陳 琳 白義鳳 羅樹春

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miR-214在胃癌患者外周血中的表達及其臨床意義

陳 琳 白義鳳 羅樹春

目的 探討miR-214在胃癌中的表達及臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法，檢測40例胃癌患者癌組織及癌旁組織中miR-214的差異表達；同時檢測血漿miR-214在56例胃癌患者及40例正常組織中的表達。結(jié)果 miR-214在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織；與正常組織比較，胃癌患者中的血漿miR-214表達明顯增高；血漿miR-214表達與患者性別、年齡無關(guān)，與疾病分期及生存期密切相關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)疾病分期、miR-214的表達可作為獨立的預(yù)后因子(P<0.05)。結(jié)論 循環(huán)miR-214表達與胃癌腫瘤分期和生存時間相關(guān),檢測循環(huán)miR-214可能作為評估胃癌患者臨床預(yù)后的靶基因。

胃癌；實時熒光定量PCR；循環(huán)miR-214

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:894～899)

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中居第二位，我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，胃癌確診的患者約90%為進展期，五年生存率不足25%[1]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療仍然是包括胃癌在內(nèi)的所有腫瘤診治的關(guān)鍵[2]。MicroRNA是1種內(nèi)源性的非編碼RNA(ncRNA)，由17～25個堿基組成的單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細胞生命活動。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在很多腫瘤中異常表達，與腫瘤的形成、侵襲轉(zhuǎn)移、分期預(yù)后、治療反應(yīng)、療效預(yù)測等密切相關(guān)[3-4]。血漿里同樣可以檢測到miRNA，循環(huán)的miRNA來源于腫瘤組織，受內(nèi)源性RNA酶的保護[5]具有較好的穩(wěn)定性和特異性?？勺鳛闈撛诘臒o創(chuàng)性診斷、治療和預(yù)后評估的分子生物學(xué)標(biāo)志物[6]。目前在淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌患者血漿中檢測到腫瘤相關(guān)的miRNA[7-9]。miR-214是miRNAs家族中的1個重要分子，在前期大量的研究表明miR-214在不同組織來源腫瘤中表達水平也各有不同，其表達水平與腫瘤的臨床特征具有相關(guān)性，也可通過不同途徑影響腫瘤的發(fā)生、進展以及藥物治療耐藥性等多個方面[10]。研究發(fā)現(xiàn),miR-214 在鼻咽癌[11],骨肉瘤[12],膠質(zhì)瘤[13],膀胱癌[14-15]等腫瘤中表達升高。Yang等[16]發(fā)現(xiàn),在353 例的臨床胃癌 miRNA 表達譜中,let-7g 和 miR-433 的低表達與miR-214的高表達是胃癌浸潤度、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的獨立危險因素；Wang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)miR-214,miR-221和miR-222 在胃癌間充質(zhì)干細胞及胃癌組織中高表達，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈血栓和TNM分期相關(guān)，以上研究結(jié)果高度提示 miR-214在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移當(dāng)中發(fā)揮重要的作用。然而關(guān)于血漿miR-214在胃癌患者血液標(biāo)本中的表達及與臨床預(yù)后的關(guān)系的研究目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

56例胃癌患者血液標(biāo)本為確診胃癌后尚未行放化療和手術(shù)治療的標(biāo)本，其中40例接受手術(shù)治療，16例未行手術(shù)，標(biāo)本取自2008年1月至2013年3月就診于四川省人民醫(yī)院腫瘤科、胃腸外科的患者，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：56例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和復(fù)查隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2013年3月31日，至隨訪截止日，依然生存20例，死亡36例，無失訪病例。

1.2 RNA的提取

血漿RNA提?。?00 μL低溫保存的血漿標(biāo)本，置于冰上融化，且充分混勻。加入500 μL TRIzol，vortex 劇烈震蕩30 s，室溫靜置5 min;加200 μL異丙醇，顛倒混勻，vortex 劇烈震蕩2 min(至液體透明)，室溫靜置5 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心15 min將上清液移至新eppendorf管;加500 μL三氯甲烷，顛倒混勻，vortex劇烈震蕩1 min，室溫靜置5 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心15 min，將上清移至新的eppendorf 管;加0.75體積的異丙醇至上清中，顛倒混勻，室溫靜置10 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心10 min，沉淀RNA;吸棄上清，沉淀用體積分數(shù)75%乙醇洗1次;4 ℃，離心半徑6.9 cm，7 500 r/min離心5 min，沉淀RNA;吸凈乙醇，30 μLDEPC水溶解RNA。

組織RNA提?。菏占赴┌┙M織及癌旁組織(約50～100 mg)在液氮中磨成粉末后，加入1 ml Trizol液研磨(樣品總體積不超過所用Trizol體積的10%)，分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。

1.3 實時熒光定量PCR分析miR-214的表達

將上述血漿及組織中提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為：16 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 10 min。結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置于冰上冷卻，后續(xù)所有步驟均在冰上進行。將cDNA產(chǎn)物稀釋3～4倍，然后混勻并從中吸取2 μl(20 μl體系)做為定量PCR的模板，剩余產(chǎn)物存放于-20 ℃。PCR反應(yīng)在ABI7500實時定量PCR反應(yīng)儀上進行，程序為(95 ℃3 min,);40 cycles×(95 ℃ 12 s,62 ℃ 1 min);95 ℃ 15 s 。反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標(biāo)準曲線等。3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式2-△△Ct的方法進行分析[18]?！鳌鱟t=(待測樣品的目的基因的Ct的平均值-待測樣本的看家基因的Ct的平均值)-(對照樣品的目的基因的Ct的平均值一對照樣本的看家基因的Ct的平均值)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

56例胃癌患者血液標(biāo)本為確診胃癌后尚未行放化療和手術(shù)治療的標(biāo)本，其中40例接受手術(shù)治療，16例未行手術(shù)，其中男性27例，女性29例；年齡30～82歲，中位年齡53歲，53歲以下患者25例，53歲以上患者31例；其中胃腺癌50例，平滑肌肉瘤1例、鱗癌2例、腺鱗癌2例、類癌1例。臨床分期：Ⅰ期(T1N0M0-T1N1M0)患者15例，Ⅱ期(T1N2M0-T3N0M0)12例，Ⅲ期(T2N2M0-T4N0M0)13例，Ⅳ期(任何TN,M1)16例。56例患者中合并糖尿病者3例，合并其他心血管疾病者2例。40例胃癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本為胃癌術(shù)后活檢組織，所有標(biāo)本均為經(jīng)病理學(xué)檢查確診的胃癌，全部病例獲取前均未行化療和放療，臨床資料完整。40例正常血液標(biāo)本取自正常人體檢血液標(biāo)本，體檢證實未患腫瘤及其他疾病(表1)。

2.2 miR-214 在胃癌患者血液及組織中的表達

采用QRT-PCR對40例胃癌組織標(biāo)本中miR-214的表達進行檢測，結(jié)果提示miR-214在胃癌患者癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A，P<0.001)。ROC曲線比較miR-214在胃癌組織和癌旁組織中的表達，曲線下面積(AUC)為0.707(95% CI=0.519～0.874,P=0.009，圖1B及表2)。根據(jù)ROC曲線，將miR-214=0.674作為判定胃癌的閾值，根據(jù)這個閾值，預(yù)測其敏感度、特異度、真陽性率和假陰性率分別為65.8%(95% CI,53.2～75.3),88.3%(95% CI,77.1～99.9),100.0%(95% CI,83.5～99.6),43.5%(95% CI,25.5～65.2)。

表1 胃癌患者及正常人的臨床特征/例

同時，采用QRT-PCR對56例胃癌患者和40例正常人血漿中miR-214的表達進行檢測，結(jié)果提示miR-214在56例胃癌患者血漿中其表達明顯高于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖2A，表2),ROC曲線圖提示曲線下面積為0.820(95% CI =0.740～0.900,P<0.001,圖2B)。miR-214=0.62作為判定胃癌的閾值，根據(jù)這個閾值，預(yù)測其敏感度、特異度、真陽性率和假陰性率分別為61.3%(95% CI,50.32～72.17),83.6%(95% CI,78.7～99.6),100.00%(95% CI,85.5～99.9),45.5%(95% CI,26.31～64.27)。

A為QRT-PCR檢測m，B為ROC曲線分析。

A為QRT-PCR檢測；B為ROC曲線分析。

2.3 miR-214表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

分析循環(huán)miR-214的表達與胃癌患者年齡、性別、疾病分期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-214表達與患者性別、年齡無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)(P均大于0.05)；與疾病分期密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001；表2)。

表2 miR-214表達與患者臨床特征的關(guān)系/例

#以2-△△ct<1為miR-214低表達，2-△△ct>1為miR-214高表達[19]。

2.4 胃癌患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性患者與女性患者的生存時間無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.525，P=0.830)，不超過53歲的患者與53歲以上患者生存時間無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.049，P=0.902)；miR-214低表達者的生存時間長于高表達者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.774，P<0.001)；患者的TNM分期越晚者生存時間越短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=61.180，P<0.001)見圖3A,B。

Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期及miR-214表達與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)疾病分期和miR-214可作為獨立的預(yù)后因子，TNM分期越晚的相對危險度為7.642，95%相對危險度的可信區(qū)間為(2.329～25.080),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(W=11.250,P=0.001)；miR-214高表達的相對危險度為8.632，95%相對危險度的可信區(qū)間為(4.015～23.351)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(W=8.224,P=0.004)見表3。

3 討論

我國胃癌具有發(fā)病率高、早期診斷率低、5年生存率低等特點。胃癌的早期診斷率仍徘徊在10%～20%，是導(dǎo)致其死亡率居高居不下的主要原因之一[2]。目前手術(shù)治療是唯一經(jīng)證實的可能會治愈胃癌的手段，但即便是已行胃癌根治術(shù)的患者，仍有大部分會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。術(shù)后的輔助放化療對控制胃癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可能有效?；熢谕砥谖赴┗颊叩木C合性治療中亦發(fā)揮重要作用，然而耐藥一直以來是胃癌化療遇到一個很大瓶頸[20-21]。由此得出，胃癌的早期診斷和及時有效的治療是提高其5年生存率的關(guān)鍵，所以尋找敏感而特異性強的分子標(biāo)志物、明確治療的分子靶標(biāo)以及正確的進行預(yù)后評估則是至關(guān)重要的任務(wù)。miRNA在不同種腫瘤中的差異表達及其與腫瘤的分類和診斷的相關(guān)性,提示其可能成為腫瘤預(yù)后檢測的重要生物標(biāo)志分子[8]。過去一直認為 miRNAs可能被細胞外大量存在的RNA酶所降解,初期研究主要針對細胞內(nèi)miRNAs。2008 年,牛津大學(xué) Lawrie 等[22]首次報道B 細胞淋巴瘤血清中miR-155,miR-210及miR-21 增高。隨后大量實驗證明miRNAs可以廣泛而穩(wěn)定地存在于細胞外液,包括血清、血漿、組織間液及各類體液中,統(tǒng)稱為循環(huán)miRNAs(circulating miRNAs)[23]。迄今已報道在健康人血液循環(huán)中約含有1800多種miRNAs。循環(huán)miRNAs作為1種非創(chuàng)傷性檢測標(biāo)志物,是人類疾病診斷與防治新的研究靶標(biāo)。有關(guān)循環(huán)miRNAs作為生物標(biāo)志物的研究目前主要集中于腫瘤,約占總體研究報道的80%左右。Lawrie 等[22]首次報道B細胞淋巴瘤血清中miR-155、miR-210及miR-21增高,且血清miR-21水平高的患者無復(fù)發(fā)生存期更長。Wong 等[24]發(fā)現(xiàn) miR-184 不僅高表達于舌鱗狀細胞癌組織局部,也表達于外周血中,其水平在手術(shù)后顯著降低。Mitchell 等[25]用基因芯片和測序技術(shù)直接測定前列腺癌患者與小鼠模型血漿中的miRNAs,證實血漿中miR-141可用于前列腺癌的鑒別診斷。Wu 等[26]報道乳腺癌 患者血清中 miR-21 和 miR-29 顯著升高,可望成為乳腺癌的生物標(biāo)志物。還有研究顯示，血漿 miR-200c可能作為預(yù)測胃癌預(yù)后及生存時間的生物學(xué)標(biāo)記物；miR-421 及miR-375作為診斷晚期胃癌的1個功能性標(biāo)志物[27-28]。然而關(guān)于循環(huán)miR-214在胃癌血漿中的表達及其意義目前尚未見相關(guān)報道。我們采用QRT-PCR分別對40例胃癌患者癌組織及癌旁組織,56例胃癌病人和40例正常人血漿中miR-214的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌病人組織標(biāo)本中miR-214的相對表達水平明顯高于癌旁組織；循環(huán)中miR-214的相對表達水平明顯高于健康對照組。ROC曲線分析證實miR-214作為區(qū)分胃癌患者和正常對照的潛在分子標(biāo)記。miR-214的表達與患者的性別、年齡無相關(guān)性，與患者的疾病分期及生存期密切相關(guān)。采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，患者的生存時間與性別、年齡無關(guān)，與疾病的分期及miR-214的表達相關(guān)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)疾病分期和miR-214可能作為獨立的預(yù)后因子。我們的研究結(jié)果與Zhang等[29]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-214在胰腺癌中是高表達的，并且miR-214可通過抑制靶基因ING4的表達從而降低胰腺癌細胞對吉西他濱化療藥物的敏感性。Yu等[30]的研究也表明miR-214可提高人舌鱗癌細胞株的化療敏感性一致。本研究結(jié)果可能為基于miR-214判斷胃癌預(yù)后的研究提供一定的理論基礎(chǔ)和治療靶點，然而影響胃癌預(yù)后的因素很多，miR-214是通過何種途徑影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其機制目前尚未完全闡明，值得進一步研究。

圖3 miR-214表達及疾病分期與患者生存時間的關(guān)系

表3 Cox回歸分析疾病分期和miR-214表達與胃癌預(yù)后的關(guān)系

[1] Ali Z,Deng Y,Ma C.Progress of research in gastric cancer〔J〕.J Nanosci Nanotechnol,2012,12(11):8241-8248.

[2] Pietrantonio,F,F De Braud,V Da Prat,et al.A review on biomarkers for prediction of treatment outcome in gastric cancer〔J〕.Anticancer Res,2013,33(4):1257-1266.

[3] Krell J,Frampton AE,Stebbing J.MicroRNAs in the cancer clinic〔J〕.Front Biosci(Elite Ed),2013,5:204-213.

[4] Chou J,Shahi P,Werb Z.microRNA-mediated regulation of the tumor microenvironment〔J〕.Cell Cycle,2013,12(20):3262-3271.

[5] Allegra A,Alonci A,Campo S,et al.Circulating microRN- As:new biomarkers in diagnosis,prognosis and treatment of cancer〔J〕.Int J Oncol,2012,41(6):1897-1912.

[6] Huang Z,Huang D,Ni S,et al.Plasma microRNAs are pro- mising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer〔J〕.Int J Cancer,2009,4(1):89-95.

[7] Ilhan-Mutlu A,Wagner L，Preusser M.Circulating biomarkers of CNS tumors:an update〔J〕.Biomark Med,2013,7(2):267-285.

[8] Redova M,Sana J，Slaby O.Circulating miRNAs as new blood-based biomarkers for solid cancers〔J〕.Future Oncol,2013,9(3):387-402.

[9] Sita-Lumsden A,Dart DA,Waxman J,et al.Circulating microRNAs as potential new biomarkers for prostate cancer〔J〕.Br J Cancer,2013,108(10):1925-1930.

[10] Wang X,Chen J,Li F,et al.MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of beta-catenin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2012,428(4):525-531.

[11] Zhang ZC,Li YY,Wang HY,et al.Knockdown of miR-214 promotes apoptosis and inhibits cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.PLoS One,2014,9(1):e86149.

[12] Xu Z，Wang T.miR-214 promotes the proliferation and invasion of osteosarcoma cells through direct suppression of LZTS1〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2014,449(2):190-195.

[13] Wang S,Jiao B,Geng S,et al.Combined aberrant expression of microRNA-214 and UBC9 is an independent unfavorable prognostic factor for patients with gliomas〔J〕.Med Oncol,2014,31(1):767.

[14] Kim SM,Kang HW,Kim WT,et al.Cell-Free microRNA-214 From Urine as a Biomarker for Non-Muscle-Invasive Bladder Cancer〔J〕.Korean J Urol,2013,54(11):791-796.

[15] Srivastava A,Goldberger H,Dimtchev A,et al.MicroRNA profiling in prostate cancer--the diagnostic potential of urinary miR-205 and miR-214〔J〕.PLoS One,2013,8(10):e76994.

[16] Yang TS,Yang XH,Wang XD,et al.MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation,migration and invasion by targeting PTEN〔J〕.Cancer Cell Int,2013,13(1):68.

[17] Wang M,Zhao C,Shi H,et al.Deregulated microRNAs in gastric cancer tissue-derived mesenchymal stem cells:novel biomarkers and a mechanism for gastric cancer〔J〕.Br J Cancer,2014,110(5):1199-1210.

[18] Hu A,Huang JJ,Xu WH,et al.miR-21 and miR-375 microRNAs as candidate diagnostic biomarkers in squamous cell carcinoma of the larynx:association with patient survival〔J〕.Am J Transl Res,2014.6(5):604-613.

[19] Yang L,Hu H,Deng Y,et al.Role of SPHK1 regulates m- ulti-drug resistance of small cell lung cancer and its clinical significance〔J〕.Zhongguo Fei Ai Za Zhi,2014,17(11):769-777.

[20] Oba K,Paoletti X,Bang YJ,et al.Role of chemotherapy for advanced/recurrent gastric cancer:an individual-patient-data meta-analysis〔J〕.Eur J Cancer,2013,49(7):1565-1577.

[21] Taketa T,Sudo K,Wadhawa R,et al.Adjuvant therapy in gastric cancer:what is the optimal approach〔J〕.Curr Oncol Rep,2013,15(2):146-151.

[22] Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma〔J〕.Br J Haematol,2008,141(5):672-675.

[23] Tie Y,Liu B,Fu H,et al.Circulating miRNA and cancer diagnosis〔J〕.Sci China C Life Sci,2009,52(12):1117-1122.

[24] Wong TS,Liu XB,Wong BY,et al.Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue〔J〕.Clin Cancer Res,2008,14(9):2588-2592.

[25] Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating micro- RNAs as stable blood-based markers for cancer detection〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[26] Wu Q,Lu Z,Li H,et al.Next-generation sequencing of microRNAs for breast cancer detection〔J〕.J Biomed Biotechnol,2011,2011(1110-7243):597145.

[27] Zhou H,Xiao B,Zhou F,et al.MiR-421 is a functional marker of circulating tumor cells in gastric cancer patients〔J〕.Biomarkers,2012,17(2):104-110.

[28] Zhang WH,Gui JH,Wang CZ,et al.The identification of miR-375 as a potential biomarker in distal gastric adenocarcinoma〔J〕.Oncol Res,2012,20(4):139-147.

[29] Zhang XJ,Ye H,Zeng CW,et al.Dysregulation of miR-15a and miR-214 in human pancreatic cancer〔J〕.J Hematol Oncol,2010,3(1):46.

[30] Yu ZW,Zhong LP,Ji T,et al.MicroRNAs contribute to the chemoresistance of cisplatin in tongue squamous cell carcinoma lines〔J〕.Oral Oncol,2010,46(4):317-322.

(編輯：吳小紅)

Expression and Significance of miR-214 in Patients with Gastric Cancer

CHENLin,BAIYifeng,LUOShuchun.

SichuanProvincialPeople'sHospital，Sichuan,610000

Objective To analyze the expression of miR-214 in gastric cancer,and its clinical significance.Methods The expression of miR-214 were confirmed in primary gastric cancer tissues and para-carcinoma tissues by QRT-PCR；Meanwhile，the expression of plasma miR-214 were detected in 56 consecutive gastric cancer patients and 40 healthy volunteers and the clinical significance was evaluated.Results Expression of miR-214 was significantly higher in gastric cancer tissues than in para-carcinoma tissues；Plasma miR-214 concentrations were significantly higher in gastric cancer patients than that in normal people(P<0.05)；The expression of plasma miR-214 were not associated with gender,and age(P>0.05),but significantly correlated with overall survival and clinical stage(P<0.001).Cox regression analysis found that plasma miR-214 expression and disease stage were independent prognostic factors for the gastric cancer patients.Conclusion Plasma miR-214 is related with clinical stage and survival of gastric cancer,it could be a useful biomarker for evaluation of prognosis of gastric cancer.

Gastric cancer;QRT-PCR;miR-214

610000 四川省人民醫(yī)院

羅樹春

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.007

R735.2

A

1001-5930(2017)06-0894-06

2016-06-08

2017-04-10)