孟 瑋 劉 博 張 敬 史曉宇 宗治國(guó)

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絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3在結(jié)腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

孟 瑋 劉 博 張 敬 史曉宇 宗治國(guó)

目的 探討結(jié)腸癌中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)及其相關(guān)性研究。方法 結(jié)腸癌病例樣本共計(jì)48例，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR的方法，檢測(cè)其中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)分析結(jié)腸癌與其表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)腸癌中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌存在相關(guān)性(P<0.05)；絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；絲氨酸/蘇氨酸激酶15表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)病及淋巴轉(zhuǎn)移的具有相關(guān)性。結(jié)論 絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)量在結(jié)腸癌中具有相關(guān)性，絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌的預(yù)后顯著相關(guān)。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3；相對(duì)表達(dá)量；結(jié)腸癌；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:879～882)

近年來(lái)，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷的上升，而且有年輕化的趨勢(shì)，腫瘤呈現(xiàn)局部侵襲性，且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。盡管近二十年來(lái)隨著新輔助化療和綜合治療的臨床應(yīng)用，結(jié)腸癌的療效已經(jīng)顯著提高，但仍有30%以上患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為其死亡的主要原因，因此研究結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移以及侵襲的分子機(jī)制對(duì)于改善結(jié)腸癌的預(yù)后具有重要的臨床意義[1]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3是一中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其中最引人關(guān)注的是，已有大量研究證明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3參與調(diào)控與細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、分化和凋亡相關(guān)的功能性基因及細(xì)胞因子基因的表達(dá)[2]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15在免疫細(xì)胞中，可以特異性地與細(xì)胞因子MIF結(jié)合，激活胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化，進(jìn)而由MAPK通路調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[2-3]。因此，本課題擬用分子生物學(xué)和免疫組織學(xué)技術(shù)，分析絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況，探討與結(jié)腸癌表達(dá)的關(guān)系，總結(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3是否可作為結(jié)腸癌早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病情監(jiān)測(cè)標(biāo)記物，揭示絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3與結(jié)腸癌的預(yù)后關(guān)聯(lián)性，為結(jié)腸癌的早期診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2012年1月至2014年1月我院胃腸外科行結(jié)腸癌手術(shù)的患者48例，平均年齡為(52.36±6.53)歲，患者年齡40～65歲。對(duì)所有手術(shù)治療的患者進(jìn)行隨訪觀察，平均隨訪時(shí)間為12個(gè)月。同時(shí)納入健康對(duì)照組患者30例，其一般資料與結(jié)腸癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，見(jiàn)表1。所有病例患者簽訂知情同意書(shū)，該臨床試驗(yàn)通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 RNA提取及RT-PCR反應(yīng)

48例結(jié)腸癌手術(shù)后對(duì)其行RNA提取，采用RNA提取試劑盒、TaqMan RNA試劑盒檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的相對(duì)表達(dá)量。采用RNU6作為內(nèi)參進(jìn)行校正。對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)水平采用二步法檢測(cè)，第一步通過(guò)莖環(huán)引物合成互補(bǔ)DNA，對(duì)10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)采用的是RNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液至PCR管，將總RNA濃度調(diào)整至2 ng/μl，在以上基礎(chǔ)上加入5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，并將反應(yīng)體系冰上反應(yīng)5 min，接著行梯度變性反應(yīng)，時(shí)間溫度遞減；第二步Platinum SYBR Green qPCR反應(yīng)體系，Taqman RNA的特異性引物與2×的 PCR Taqman Universal的混合液，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，首先將5 μl cDNA加入RNA當(dāng)中，擴(kuò)增至20 μl，遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán)：94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min之后，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按照PCR操作說(shuō)明，采用熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)。應(yīng)用計(jì)算公式計(jì)算：△Ct=Ct絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3-CtRNU6的計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)

組間率的比較用卡方檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料采用方差分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的以P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組中絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3相對(duì)表達(dá)量比較

結(jié)腸癌組中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3mRNA的表達(dá)值高于對(duì)照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 結(jié)腸癌絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

2.2 絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.3 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)病及淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

絲氨酸/蘇氨酸激酶15表達(dá)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)病及淋巴轉(zhuǎn)移的具有相關(guān)性，見(jiàn)表4。

表4 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3與結(jié)腸癌發(fā)病及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌位于全世界癌癥發(fā)病率排行的第三位，也是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。多年來(lái)該病的發(fā)病率保持逐年上升的趨勢(shì)。其中該病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是影響患者預(yù)后及治療效果的關(guān)鍵因素[4-6]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)模式與分子遺傳學(xué)特性逐步被發(fā)現(xiàn)和了解。結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是1個(gè)多因素作用的復(fù)雜過(guò)程。雖然廣大醫(yī)學(xué)和科研工作者進(jìn)行了充分且細(xì)致的研究，但是目前對(duì)于結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，仍然缺乏有效且可靠的方法檢測(cè)以及預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸[7-9]。對(duì)于結(jié)腸癌相關(guān)的基因表達(dá)的研究，不僅對(duì)臨床上結(jié)腸癌的分子生物學(xué)分型、早期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)，還可以闡明結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、以及轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的機(jī)制，且對(duì)治療評(píng)估有著重要的意義[10]，而對(duì)于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)并闡明其分子表面標(biāo)志物的表達(dá)模式，對(duì)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的靶向分子治療也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[11]。因此尋找生物學(xué)靶標(biāo)對(duì)于疾病的診治至關(guān)重要，本研究為探求該病的侵襲機(jī)制，尋找靶點(diǎn)基因與疾病的相關(guān)性，對(duì)該病的治療和預(yù)后判斷提供一定的指導(dǎo)價(jià)值。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是1種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究中被發(fā)現(xiàn)[12]。STAT3可以在細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激下激活，并直接入核，激活相應(yīng)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。STAT3由750個(gè)氨基酸組成，其分子量約為91kD。其DNA結(jié)合域可識(shí)別的DNA序列堿基數(shù)較短，因此可以激活多個(gè)靶基因的表達(dá)。已有大量研究證明STAT3參與調(diào)控與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、分化以及凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子、功能性基因的表達(dá)。STAT3在肺癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中均存在異常表達(dá)。對(duì)該基因下游的信號(hào)通路也產(chǎn)生一定的影響，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移也發(fā)揮著重要的作用。STAT3在結(jié)腸癌中的表達(dá)已有文獻(xiàn)報(bào)道。然而其在結(jié)腸癌細(xì)胞中起到的作用尚未完全闡明[13]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15是1類(lèi)分子表面標(biāo)志物。已有研究證明絲氨酸/蘇氨酸激酶15在乳癌、肝癌及白血病細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)[13]。在免疫細(xì)胞中，可以特異性地與細(xì)胞因子MIF結(jié)合，激活胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化。既往有研究證實(shí)，MAPK信號(hào)通路是STAT家族多種分子基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)通路；而絲氨酸/蘇氨酸激酶15共刺激信號(hào)可能與STAT3存在循環(huán)正反饋的雙向調(diào)控機(jī)制；絲氨酸/蘇氨酸激酶15與STAT3的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。絲氨酸/蘇氨酸激酶15還可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成間接刺激腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14]。因此，絲氨酸/蘇氨酸激酶15對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多方面多層次影響的，其主要通過(guò)自身分泌、相關(guān)受體、胞內(nèi)相關(guān)因子等環(huán)節(jié)影響腫瘤細(xì)胞的遷移和粘附以及凋亡和分化能力，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移。但是其具體調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)，尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸激酶15在腫瘤發(fā)生于發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。而STAT3和絲氨酸/蘇氨酸激酶15之間是否存在著相互作用可以有助于更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生于發(fā)展的過(guò)程，因此本研究探討兩者相互作用對(duì)結(jié)腸癌的之間的相關(guān)性，希望能進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制[15]。

通常細(xì)胞發(fā)生病變轉(zhuǎn)化會(huì)造成相關(guān)基因的表型及其相關(guān)分子的相應(yīng)變化，這些變化都可能成為細(xì)胞程序性惡化的誘因，且與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)特征不同，因此可為我們分析尋找新的結(jié)腸癌作用靶點(diǎn)及標(biāo)志物提供一定線索。在對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3的研究基礎(chǔ)上，我們通過(guò)本研究深入探討絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3作為診斷(早期診斷)、病情監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物的可能性；研究絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3共表達(dá)的狀況和消長(zhǎng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)2指標(biāo)之間具有互補(bǔ)應(yīng)用的可能性。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌結(jié)腸癌絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌存在相關(guān)性，兩者的相對(duì)表達(dá)量水平與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移具有著相關(guān)性，絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3在結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)移方面差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果為結(jié)腸癌的早期防治提供新的思路和藥物作用的靶標(biāo)，同時(shí)為理解該病的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的治療藥物提供依據(jù)，更深入的分子機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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(編輯：吳小紅)

Expression of Serine/Threonine Kinase 15 and Signal Transduction Activator of Transcription 3 in Colon Cancer and Their Correlation

MENGWei，LIUBo，ZHANGJing，etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075000

Objective To investigate the expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction transcription factor 3 in colon cancer and their correlation.Methods A total of 48 cases of colorectal cancer cases were treated with reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR.The relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator 3 was analyzed,and relationship between colorectal cancer and its expression were analyzed.Results The relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 in colorectal cancer were correlated with colon cancer(P<0.05);serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 were correlated with colon cancer metastasis(P<0.05).The expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 were correlated with the pathogenesis and lymph node metastasis of colon cancer.Conclusion The expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription factor 3 are associated with colon cancer,the relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator 3 are closely associated with the prognosis of colon cancer.

Serine/threonine kinase 15;Signal transduction transcriptional activator 3;Relative expression;Colon cancer;Prognosis

075000 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.003

R735.3+5

A

1001-5930(2017)06-0879-04

2016-07-08

2017-03-12)