孟 瑋 劉 博 張 敬 史曉宇 宗治國

?

絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3在結腸癌中的表達及相關性研究

孟 瑋 劉 博 張 敬 史曉宇 宗治國

目的 探討結腸癌中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3表達及其相關性研究。方法 結腸癌病例樣本共計48例，采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應RT-PCR的方法，檢測其中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的相對表達量，同時分析結腸癌與其表達量的關系。結果 結腸癌中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的相對表達量與結腸癌存在相關性(P<0.05)；絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3與結腸癌轉移顯著相關(P<0.05)；絲氨酸/蘇氨酸激酶15表達信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌發(fā)病及淋巴轉移的具有相關性。結論 絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號轉導轉錄激活因子3表達量在結腸癌中具有相關性，絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3相對表達量與結腸癌的預后顯著相關。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15；信號轉導轉錄激活因子3；相對表達量；結腸癌；預后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:879～882)

近年來，我國結腸癌的發(fā)病率不斷的上升，而且有年輕化的趨勢，腫瘤呈現(xiàn)局部侵襲性，且極易發(fā)生轉移。盡管近二十年來隨著新輔助化療和綜合治療的臨床應用，結腸癌的療效已經(jīng)顯著提高，但仍有30%以上患者出現(xiàn)復發(fā)和轉移，為其死亡的主要原因，因此研究結腸癌的轉移以及侵襲的分子機制對于改善結腸癌的預后具有重要的臨床意義[1]。信號轉導轉錄激活因子3是一中重要的核轉錄因子，其中最引人關注的是，已有大量研究證明信號轉導轉錄激活因子3參與調控與細胞發(fā)生、發(fā)展、分化和凋亡相關的功能性基因及細胞因子基因的表達[2]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15在免疫細胞中，可以特異性地與細胞因子MIF結合，激活胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化，進而由MAPK通路調控多種轉錄因子的表達[2-3]。因此，本課題擬用分子生物學和免疫組織學技術，分析絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3在結腸癌患者中的表達情況，探討與結腸癌表達的關系，總結絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3是否可作為結腸癌早期診斷、術前輔助診斷和病情監(jiān)測標記物，揭示絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3與結腸癌的預后關聯(lián)性，為結腸癌的早期診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

納入2012年1月至2014年1月我院胃腸外科行結腸癌手術的患者48例，平均年齡為(52.36±6.53)歲，患者年齡40～65歲。對所有手術治療的患者進行隨訪觀察，平均隨訪時間為12個月。同時納入健康對照組患者30例，其一般資料與結腸癌組比較差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性，見表1。所有病例患者簽訂知情同意書，該臨床試驗通過我院倫理委員會批準。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 RNA提取及RT-PCR反應

48例結腸癌手術后對其行RNA提取，采用RNA提取試劑盒、TaqMan RNA試劑盒檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的相對表達量。采用RNU6作為內(nèi)參進行校正。對絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的表達水平采用二步法檢測，第一步通過莖環(huán)引物合成互補DNA，對10 ng RNA進行逆轉采用的是RNA的逆轉錄系統(tǒng)，加入10 μl的逆轉錄緩沖液至PCR管，將總RNA濃度調整至2 ng/μl，在以上基礎上加入5 μl的逆轉錄引物，并將反應體系冰上反應5 min，接著行梯度變性反應，時間溫度遞減；第二步Platinum SYBR Green qPCR反應體系，Taqman RNA的特異性引物與2×的 PCR Taqman Universal的混合液，通過逆轉錄體系進行反應，首先將5 μl cDNA加入RNA當中，擴增至20 μl，遞減的擴張40個循環(huán)：94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min之后，分析實驗數(shù)據(jù)，按照PCR操作說明，采用熒光實時定量反應。應用計算公式計算：△Ct=Ct絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3-CtRNU6的計算出相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學檢測

組間率的比較用卡方檢驗，組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間計數(shù)資料采用方差分析，具有統(tǒng)計學差異的以P<0.05表示。

2 結果

2.1 兩組中絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號轉導轉錄激活因子3相對表達量比較

結腸癌組中絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3mRNA的表達值高于對照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 結腸癌絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的相對表達量的相關性

2.2 絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌臨床病理參數(shù)的相關性

絲氨酸/蘇氨酸激酶15與信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌轉移顯著相關(P<0.05)；與患者年齡無相關性(P>0.05)，見表3。

表3 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌臨床參數(shù)的相關性

2.3 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌發(fā)病及淋巴轉移的相關性

絲氨酸/蘇氨酸激酶15表達與信號轉導轉錄激活因子3表達與結腸癌發(fā)病及淋巴轉移的具有相關性，見表4。

表4 絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3與結腸癌發(fā)病及淋巴結轉移的相關性

3 討論

結腸癌位于全世界癌癥發(fā)病率排行的第三位，也是我國常見的消化道惡性腫瘤之一。多年來該病的發(fā)病率保持逐年上升的趨勢。其中該病的復發(fā)和轉移，是影響患者預后及治療效果的關鍵因素[4-6]。近年來，隨著分子生物學技術的不斷進步與發(fā)展，結腸癌的復發(fā)轉移相關的生物學模式與分子遺傳學特性逐步被發(fā)現(xiàn)和了解。結腸癌的轉移和復發(fā)是1個多因素作用的復雜過程。雖然廣大醫(yī)學和科研工作者進行了充分且細致的研究，但是目前對于結腸癌的轉移和復發(fā)，仍然缺乏有效且可靠的方法檢測以及預測疾病的轉歸[7-9]。對于結腸癌相關的基因表達的研究，不僅對臨床上結腸癌的分子生物學分型、早期診斷、復發(fā)及轉移的早期檢測，還可以闡明結腸癌的發(fā)生、發(fā)展、以及轉移及復發(fā)的機制，且對治療評估有著重要的意義[10]，而對于轉移復發(fā)的結腸癌，發(fā)現(xiàn)并闡明其分子表面標志物的表達模式，對復發(fā)及轉移性結腸癌的靶向分子治療也具有重要的應用價值[11]。因此尋找生物學靶標對于疾病的診治至關重要，本研究為探求該病的侵襲機制，尋找靶點基因與疾病的相關性，對該病的治療和預后判斷提供一定的指導價值。

信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)是1種重要的核轉錄因子，在干擾素信號傳導通路的研究中被發(fā)現(xiàn)[12]。STAT3可以在細胞受到外界信號刺激下激活，并直接入核，激活相應的靶基因的轉錄。STAT3由750個氨基酸組成，其分子量約為91kD。其DNA結合域可識別的DNA序列堿基數(shù)較短，因此可以激活多個靶基因的表達。已有大量研究證明STAT3參與調控與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、分化以及凋亡相關的細胞因子、功能性基因的表達。STAT3在肺癌、肝細胞癌和乳腺癌等惡性腫瘤細胞中均存在異常表達。對該基因下游的信號通路也產(chǎn)生一定的影響，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉移也發(fā)揮著重要的作用。STAT3在結腸癌中的表達已有文獻報道。然而其在結腸癌細胞中起到的作用尚未完全闡明[13]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15是1類分子表面標志物。已有研究證明絲氨酸/蘇氨酸激酶15在乳癌、肝癌及白血病細胞等多種腫瘤細胞表面表達[13]。在免疫細胞中，可以特異性地與細胞因子MIF結合，激活胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化。既往有研究證實，MAPK信號通路是STAT家族多種分子基因表達的調控信號通路；而絲氨酸/蘇氨酸激酶15共刺激信號可能與STAT3存在循環(huán)正反饋的雙向調控機制；絲氨酸/蘇氨酸激酶15與STAT3的表達存在一定的相關性。絲氨酸/蘇氨酸激酶15還可上調血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進腫瘤血管生成間接刺激腫瘤生長和轉移[14]。因此，絲氨酸/蘇氨酸激酶15對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多方面多層次影響的，其主要通過自身分泌、相關受體、胞內(nèi)相關因子等環(huán)節(jié)影響腫瘤細胞的遷移和粘附以及凋亡和分化能力，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲和轉移。但是其具體調控機制及信號傳導，尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸激酶15在腫瘤發(fā)生于發(fā)展過程中起著重要的調控作用。而STAT3和絲氨酸/蘇氨酸激酶15之間是否存在著相互作用可以有助于更好地了解結腸癌發(fā)生于發(fā)展的過程，因此本研究探討兩者相互作用對結腸癌的之間的相關性，希望能進一步了解結腸癌的發(fā)病機制[15]。

通常細胞發(fā)生病變轉化會造成相關基因的表型及其相關分子的相應變化，這些變化都可能成為細胞程序性惡化的誘因，且與正常細胞的生長特征不同，因此可為我們分析尋找新的結腸癌作用靶點及標志物提供一定線索。在對絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3的研究基礎上，我們通過本研究深入探討絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3作為診斷(早期診斷)、病情監(jiān)測生物標記物的可能性；研究絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3共表達的狀況和消長關系，發(fā)現(xiàn)2指標之間具有互補應用的可能性。本研究結果顯示，結腸癌結腸癌絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3表達的相對表達量與結腸癌存在相關性，兩者的相對表達量水平與結腸癌的轉移具有著相關性，絲氨酸/蘇氨酸激酶15和信號轉導轉錄激活因子3在結腸癌中轉移方面差異具有統(tǒng)計學意義。研究結果為結腸癌的早期防治提供新的思路和藥物作用的靶標，同時為理解該病的分子機制，開發(fā)新的治療藥物提供依據(jù)，更深入的分子機制值得進一步探討。

[1] 赫 捷,趙 平,陳萬青.2011中國腫瘤登記年報〔M〕.北京：軍事醫(yī)學科學出版社,2012：94-211.

[2] Hohenberger W,Weber K,Matzel K,et al.Standardized surgery for colonic cancer:complete mesocolic excision and central ligation technical notes and outcome〔J〕.Colorectal Dis,2009,11(4):354-364.

[3] West NP,Hohenberger W,Weber K,et al.Complete mesocolic excision with central vascular ligation produces an oncologically superior specimen compared with standard surgery for carcinoma of the colon〔J〕.J Clin Oncol,2010,28(2):272-278.

[4] West NP,Kobayashi H,Takahashi K,et al.Understanding optimal colonic cancer surgery:comparison of Japanese D3 resection and european complete mesocolic excision with central vascular ligation〔J〕.J Clin Oncol,2012,30(15):1763-1769.

[5] Bamboat ZM,Deperalta D,Dursun A,et al.Factors affecting lymph node yield from patients undergoing colectomy for cancer〔J〕.Int J Lolorectal Dis,2011,26(9):1163-1168.

[6] Moore J,Hyman N,Callas P,et al.Staging error does not explain the relationship between the number of lymph nodes in a colon cancer specimen and survival〔J〕.Surgery，2010，147(3):358-365.

[7] Storli K,Sondenaa K,Furnes B,et a1.Improved lymph node haverst from resected colon cance specimens did not cause upstaging from TNM stageⅡto〔J〕.World J Surg，2011,35(12):2796-2803.

[8] Agesen TH,Sveen A,Merok MA,et al.ColoGuideEx:a robust gene classifier specific for stage II colorectal cancer prognosis〔J〕.Gut,2012,61(11):1560-1567.

[9] Popovici V,Budinska E,Tejpar S,et al.Identification of a poor-prognosis BRAF-mutant-like population of patients with colon cancer〔J〕.J Clin Oncol,2012,30(12):1288-95.

[10] Perez-Villamil B,Romera-Lopez A,Hernandez-Prieto S,et al.Colon cancer molecular subtypes identified by expression profiling and associated to stroma,mucinous type and different clinical behavior〔J〕.BMC Cancer,2012,12:260.

[11] Merlos-Suárez A,Barriga FM,Jung P,et al.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse〔J〕.Cell Stem Cell,2011,8(5):511-524.

[12] Salazar R,Roepman P,Capella G,et al.Gene expression signature to improve prognosis prediction of stage II and III colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol,2011,29(1):17-24.

[13] Oh SC,Park YY,Park ES,et al.Prognostic gene expression signature associated with two molecularly distinct subtypes of colorectal cancer〔J〕.Gut,2012,61(2):1291-1298.

[14] Mettu RK,Wan YW,Habermann JK,et al.A 12-gene genomic instability signature predicts clinical outcomes in multiple cancer types〔J〕.Int J Biol Markers,2010,25(4):219-28.

[15] Biagi JJ,Raphael MJ,Mackillop WJ,et al.Association between time to initiation of adjuvant chemotherapy and survival in colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.JAMA,2011,305(22):2335-2342.

(編輯：吳小紅)

Expression of Serine/Threonine Kinase 15 and Signal Transduction Activator of Transcription 3 in Colon Cancer and Their Correlation

MENGWei，LIUBo，ZHANGJing，etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075000

Objective To investigate the expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction transcription factor 3 in colon cancer and their correlation.Methods A total of 48 cases of colorectal cancer cases were treated with reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR.The relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator 3 was analyzed,and relationship between colorectal cancer and its expression were analyzed.Results The relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 in colorectal cancer were correlated with colon cancer(P<0.05);serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 were correlated with colon cancer metastasis(P<0.05).The expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription 3 were correlated with the pathogenesis and lymph node metastasis of colon cancer.Conclusion The expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator of transcription factor 3 are associated with colon cancer,the relative expression of serine/threonine kinase 15 and signal transduction activator 3 are closely associated with the prognosis of colon cancer.

Serine/threonine kinase 15;Signal transduction transcriptional activator 3;Relative expression;Colon cancer;Prognosis

075000 河北北方學院附屬第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.003

R735.3+5

A

1001-5930(2017)06-0879-04

2016-07-08

2017-03-12)