袁淑繪+王聰聰+劉曉偉+宿振國(guó)

【摘要】 目的：探討AMD3100在大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷超早期的抗炎作用。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為AMD3100處理組（AMD3100組）、溶劑對(duì)照組（PBS組）、假手術(shù)組，AMD3100組于再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）后給予AMD3100 PBS溶液腹腔注射，假手術(shù)組與PBS組于I/R后給予PBS溶液腹腔注射；各組線栓法復(fù)制120 min SD大鼠局灶性腦缺血模型，于I/R 24 h后使用ELISA法檢測(cè)各組缺血區(qū)炎癥因子IL-10、TNF-α、IL-1β含量。結(jié)果：AMD3100組較PBS組IL-10含量高，TNF-α、IL-1β含量低（P<0.05）。結(jié)論：AMD3100能夠通過(guò)抗炎作用對(duì)大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷起保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 AMD3100； 短暫性局灶性缺血性腦損傷； IL-10； IL-1β； TNF-α

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.17.081 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）17-0154-03

The Anti-inflammatory Effect of AMD3100 on the Ultra-early Time of Transient Focal Brain Ischemic Injury in Rats/YUAN Shu-hui，WANG Cong-cong，LIU Xiao-wei，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2017，15（17）：154-156

【Abstract】 Objective：To explore the anti-inflammatory effect of AMD3100 on the ultra-early time of transient focal brain ischemic injury in rats.Method：Male SD rats were randomly divided into the AMD3100 group，Vehicle group（PBS group） and Sham group，AMD3100 group was given intraperitoneal injection of AMD3100 after ischemia-reperfusion（I/R），PDB group and Sham group were given of PBS after I/R.The transient focal brain ischemia model was induced by Zea-longa modified-suture middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Inflammation factors IL-10，IL-1β，TNF-α were detected by using ELISA method.Result：The level of IL-10 was higher and the levels of IL-1β and TNF-α were lower in AMD 3100 group compared with the PBS group（P<0.05）.Conclusion：AMD3100 can improve the prognosis of cerebral ischemia by anti-inflammatory effect.

【Key words】 AMD3100； Transient focal ischemic brain injury； IL-10； IL-1β； TNF-α

First-authors address：Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

缺血性卒中最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是短暫性局灶性腦缺血[1]，有文獻(xiàn)[2]報(bào)道其后7 d內(nèi)的腦梗死發(fā)生率可高達(dá)8%～10.5%，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損甚至導(dǎo)致死亡。在短暫性局灶性腦缺血的發(fā)病過(guò)程中，在發(fā)病3～6 h（即超早期內(nèi)）如果能夠進(jìn)行積極治療，將可以大大降低后期發(fā)展為腦卒中風(fēng)險(xiǎn)[3]。前期筆者的研究“CXCLl2在大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷超早期中的作用”表明AMD3100對(duì)大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷具有保護(hù)作用[4]。本文將探討AMD3100對(duì)大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用機(jī)制中的抗炎癥作用，其他機(jī)制將在后續(xù)的研究中進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年SD雄性大鼠（200～220 g），購(gòu)買于綠葉制藥集團(tuán)（中國(guó)煙臺(tái)）。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在具有12/12 h，光照/黑暗循環(huán)（光8∶00-20∶00）的標(biāo)準(zhǔn)條件，食物和水充足。大鼠隨機(jī)（單純隨機(jī)抽樣法）分為AMD3100處理組（AMD3100組）、溶劑對(duì)照組（PBS組）、假手術(shù)組，每組各6只大鼠。除假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈外，其余兩組均行MCAO手術(shù)。假手術(shù)組與PBS組于再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）后腹腔注射PBS溶液，AMD3100組給予腹腔注射AMD3100 PBS溶液，AMD3100給藥濃度為5 mg/kg。

1.2 主要試劑與儀器

AMD3100（美國(guó)abcam公司）；IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒（美國(guó)abcam公司）；722分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 模型制備

SD大鼠短暫性局灶性腦缺血模型制作采用Zea-longa改良線栓法，步驟如下：雄性SD大鼠給予腹腔注射濃度為300 mg/kg的水合氯醛，大鼠取仰臥位，行頸部正中切口然后分離右側(cè)頸外動(dòng)脈（ECA）和頸總動(dòng)脈（CCA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），將ECA與CCA進(jìn)行結(jié)扎，選擇合適動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端，于CCA作斜形切口，將沾有肝素鈉（2.4×106U/L）的尼龍線栓插入CCA，松開(kāi)動(dòng)脈夾，線栓經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入ICA，順I(yè)CA入腦至ACA，深度（18.5±0.5）mm，左側(cè)大腦中動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)阻塞，2 h后拔出線栓然后將切口縫好，大腦中動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)再灌注。實(shí)現(xiàn)再灌注后，各組立即給予腹腔注射相應(yīng)溶液。手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，整個(gè)過(guò)程將大鼠體溫控制在37 ℃左右。使用Zea-longa建立的神經(jīng)功能缺損程度的五級(jí)四分法對(duì)清醒大鼠的行為和神經(jīng)癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，剔除不達(dá)標(biāo)者。假手術(shù)組的線栓僅插入CCA，其余步驟同上。

1.4 ELIS檢測(cè)IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)量

I/R 24 h后快速處死大鼠，在冰盤上分離右側(cè)腦組織，取右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域腦組織，距額葉前端3 mm和9 mm處進(jìn)行冠狀切割，取中間6 mm厚的腦組織塊，再沿此腦塊矢狀縫左側(cè)旁開(kāi)2 mm處，由上至下切下，右側(cè)部分即為右側(cè)MAC供血區(qū)。將腦組織與適量PBS混勻，用組織均漿器將腦組織研磨勻漿，組織勻漿于3000 r/min離心20 min，取上清液至新的EP管中，根據(jù)說(shuō)明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)空白孔和待測(cè)樣本孔，然后每孔各加入40 μl的樣品稀釋液，待測(cè)樣品孔加入10 μl待測(cè)樣品，封板膜封板，37 ℃溫箱恒溫孵育30 min，洗液清洗5次，每次30 s，然后除空白孔外各孔均加入酶標(biāo)試劑50 μl，37 ℃溫箱恒溫孵育30 min，洗液清洗5次，每次30 s。顯色：每孔加入顯色劑A和 B各50 μl，震蕩混勻，37 ℃恒溫避光顯色15 min。終止：每孔各加入終止液50 μl終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白孔調(diào)零，選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本孔的濃度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較用LSD法進(jìn)行，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用ELIAS試劑盒檢測(cè)炎癥因子IL-10、TNF-α、IL-1β的變化，結(jié)果顯示：雖然各因子含量不同，但趨勢(shì)基本相同?？寡滓蜃覫L-10的含量，AMD3100組較PBS組高；促炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，AMD3100組較PBS組低，見(jiàn)表1。

3 討論

本研究表明：大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷超早期應(yīng)用AMD3100可以提高抗炎癥因子IL-10的含量，降低促炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量。

AMD3100是CXCL12的受體拮抗劑，CXCL12是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1），又稱為前B細(xì)胞刺激因子（pre-B cell stimulatory factor，PBSF）。CXCL12有兩種受體，分別是CXCR4 和CXCR7，其中CXCR7的表達(dá)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及黏附，活化的CXCR4的表達(dá)則有利于細(xì)胞增殖和遷移，AMD3100是CXCR4的特異性阻斷劑[5]。趨化因子CXCL12及其CXCR4受體參與缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞遷徙和歸巢等生理病理過(guò)程，且與神經(jīng)的產(chǎn)生、內(nèi)分泌和變性等均有密切關(guān)系[6-8]。在缺血性腦卒中的不同時(shí)期CXCL12及其傳導(dǎo)通路具有加重?fù)p傷及促進(jìn)功能重建的雙重作用[9]。筆者以往的研究結(jié)果表明在大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷超早期，CXCL12主要是起加重?fù)p傷的作用，及早在超早期內(nèi)應(yīng)用CXCL12受體拮抗劑AMD3100，其可抑制CXCL12的活性，進(jìn)而降低短暫性局灶性腦缺血損傷，改善腦缺血的癥狀及其預(yù)后，促進(jìn)大腦功能的恢復(fù)[4]。在腦卒中動(dòng)物模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的CXCLI2表達(dá)上調(diào)[10]，CXCLI2的上調(diào)與缺血損傷區(qū)域單核細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，該研究提示CXCLI2參與卒中后的炎癥病理過(guò)程[8]。CXCL12通過(guò)參與炎癥反應(yīng)可誘發(fā)及加重急性或延遲性細(xì)胞死亡，及早應(yīng)用CXCL12受體拮抗劑AMD3100或許可阻斷CXCL12參與的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕腦損傷，這是筆者本次的研究?jī)?nèi)容。

筆者研究表明，超早期應(yīng)用CXCL12受體拮抗劑AMD3100，能夠阻斷CXCL12參與的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到抗炎作用，在缺血損傷超早期內(nèi)應(yīng)用AMD3100能夠使抗炎因子IL-10的含量增高，促炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量降低。IL-10對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用，是抗炎癥因子，其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過(guò)減少缺血后局部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而減少神經(jīng)元的凋亡而實(shí)現(xiàn)[11]。在缺血損傷超早期內(nèi)應(yīng)用AMD3100能夠降低TNF-α的表達(dá)量，目前有研究表明TNF-α具有神經(jīng)毒性，腦缺血損傷后TNF-α的含量增加[12]，TNF-α是促炎癥因子，腦缺血損傷后，TNF-α可以誘導(dǎo)IL-1β等多種細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)[13]，TNF-α還有一個(gè)重要作用就是可破壞血腦屏障導(dǎo)致外周白細(xì)胞浸潤(rùn)，引起腦水腫使腦缺血損傷進(jìn)一步加重[14]。超早期內(nèi)應(yīng)用AMD3100能夠降低IL-1β的表達(dá)量，IL-1β有加重腦損傷的作用，有研究表明IL-1β能夠增大腦缺血的梗死灶體積，使用IL-1β受體拮抗劑不僅能夠使腦缺血后梗死灶體積減小，而且使梗死灶周邊神經(jīng)元的存活數(shù)目增多[15]，筆者研究結(jié)果表明AMD3100能夠減少IL-1β的含量，進(jìn)而可減小梗死灶和減少神經(jīng)元死亡數(shù)量，使腦缺血性損傷減輕。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，在超早期內(nèi)應(yīng)用AMD3100能通過(guò)抗炎癥作用使抗炎因子IL-10的含量增高；促炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量降低，進(jìn)而對(duì)大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷起保護(hù)作用，但本研究?jī)H討論了抗炎機(jī)制中IL-10、TNF-α、IL-1β炎癥因子的變化，而其他炎癥因子以及其他作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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