王 欣，周繼春，景愛華，雷萬軍

注射用間苯三酚的非臨床安全性評價

王 欣1，周繼春1，景愛華2，雷萬軍2

目的 對注射用間苯三酚進(jìn)行臨床前動物安全性評價試驗。方法 豚鼠全身主動過敏性試驗(ASA)：在首次注射后第14天、第21天由耳緣靜脈注射供試品，觀察30 min后動物過敏反應(yīng)；豚鼠被動皮膚過敏性試驗(PCA)：皮內(nèi)注射抗血清被動致敏，24 h后注射伊文思蘭，測量藍(lán)色反應(yīng)斑；體外溶血試驗：觀察供試品3 h內(nèi)有無溶血和凝聚現(xiàn)象；血管刺激性試驗：家兔連續(xù)5 d耳緣靜脈注射供試品，觀察其對注射局部血管的刺激；肌肉刺激性試驗：家兔后肢股四頭肌內(nèi)注射供試品，觀察其對肌肉組織的刺激。結(jié)果 注射用間苯三酚豚鼠過敏性試驗中均未發(fā)生過敏反應(yīng)，溶血性試驗3 h內(nèi)未發(fā)生溶血和凝聚現(xiàn)象，血管刺激性試驗和肌肉刺激性試驗均未出現(xiàn)刺激性反應(yīng)。結(jié)論 注射用間苯三酚無過敏性反應(yīng)、刺激性反應(yīng)及溶血性，使用安全可靠。

注射用間苯三酚；安全性試驗；過敏反應(yīng)；溶血試驗；刺激性試驗

間苯三酚是一種純平滑肌解痙藥，屬非阿托品及非罌粟堿類且具有親肌性的特點(diǎn)，能直接作用于消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及生殖道的平滑肌，在婦科、泌尿科及胃腸科等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，已成為治療痙攣性疼痛的首選藥物[1-2]。本研究按照藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[3]，對注射用間苯三酚進(jìn)行了安全性試驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 藥物及試劑 注射用間苯三酚(批號：20131101，規(guī)格：80 mg，開封明仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；牛血清白蛋白(批號：A8020，規(guī)格：5 g，瑞士羅氏公司)；伊文思蘭(批號：08-11-02，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝)；甲醛(批號：20131002，煙臺市雙雙化工有限公司)；葡萄糖注射液(批號：14070915，規(guī)格：100 mL∶5.0 g，開開援生制藥股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗動物 新西蘭家兔，普通級，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，雌雄不拘，單籠飼養(yǎng)；豚鼠，清潔級，體質(zhì)量250～350 g，雌雄不拘，分籠飼養(yǎng)；均購自華蘭生物疫苗有限公司，許可證號：SCXK(豫)2010-0001；實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK(豫)2010-0008；飼養(yǎng)條件：全價營養(yǎng)飼料；溫度控制(23±2) ℃，濕度50%～65%，自由飲水，良好通風(fēng)，12 h光照明暗交替；豚鼠每日另供給新鮮蔬菜，保持動物健康狀態(tài)。

1.3 儀器 CP225D型電子天平(德國賽托利斯公司)；UW8200S型電子天平(日本島津公司)；SF2000型電子數(shù)顯卡尺(桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司)；GD100型恒溫循環(huán)水浴鍋(英國Grant公司)；CH30型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RTZ-10A-RT型嬰兒秤(無錫市衡器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 人與受試動物劑量換算

注射用間苯三酚稀釋于5%或10%葡萄糖注射液中靜脈滴注，每日劑量可達(dá)200 mg。公式(2)、(3)中d為實(shí)驗動物體質(zhì)量劑量，R為動物體型系數(shù)[4]。

按公式(1)計算臨床最大成人用劑量(人以60 kg計)：

(1)

按公式2折算成豚鼠等效劑量(豚鼠以300 g計)：

(2)

按公式3折算成家兔等效劑量(家兔以2.5 kg計)：

(3)

2.2 全身主動過敏性試驗(active systemic anaphylaxis，ASA)

取豚鼠24只，隨機(jī)分為4組[3-6]：陰性對照組、陽性對照組、供試品高劑量組、供試品低劑量組，每組6只；分別給予葡萄糖注射液、1%牛血清白蛋白、注射用間苯三酚，高劑量組致敏劑量為33.3 mg·kg-1，激發(fā)劑量為66.7 mg·kg-1，給藥濃度為20 mg·mL-1；低劑量組給予注射用間苯三酚，致敏劑量為16.7 mg·kg-1，激發(fā)劑量為33.3 mg·kg-1，給藥濃度為10 mg·mL-1。于實(shí)驗第1、3、5天每只豚鼠腹腔注射各組對應(yīng)試液0.5 mL進(jìn)行致敏。然后再將各組均分為2組，于實(shí)驗第14天和第21天由耳緣靜脈注射各組對應(yīng)試液1.0 mL進(jìn)行激發(fā)。注射后觀察30 min內(nèi)每只動物的反應(yīng)，記錄7 d內(nèi)動物出現(xiàn)的反應(yīng)，根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷。

結(jié)果：陽性對照組2只豚鼠出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽反應(yīng)、2只豚鼠死亡，為極強(qiáng)陽性(++++)；陰性對照組未出現(xiàn)過敏反應(yīng)；判斷實(shí)驗成立。注射用間苯三酚高、低劑量組在注射后及觀察期豚鼠均未發(fā)生過敏反應(yīng)。

2.3 被動皮膚過敏性試驗(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)

抗體的制備：取豚鼠8只，隨機(jī)分為4組[3-6]：陰性對照組、陽性對照組、供試品高劑量組、供試品低劑量組，每組2只，分別給予葡萄糖注射液、1%牛血清白蛋白、注射用間苯三酚，高劑量組致敏劑量為33.3 mg·kg-1，給藥濃度為20 mg·mL-1；低劑量組致敏劑量為16.7 mg·kg-1，給藥濃度為10 mg·mL-1。于實(shí)驗第1、3、5天每只豚鼠腹腔注射各組對應(yīng)試液0.5 mL進(jìn)行致敏。于實(shí)驗第14天采血，離心10 min(2 000 r·min-1)分離上層血清，合并得混合抗血清。保存于-20 ℃，14 d內(nèi)使用。

實(shí)驗方法：取豚鼠24只，分組及給藥同抗體的制備項下方法。豚鼠背部去毛約3 cm×4 cm，將各組混合抗血清按1∶4稀釋，皮內(nèi)注射0.1 mL，進(jìn)行被動致敏。24 h后進(jìn)行激發(fā)，于耳緣靜脈注射含1%伊文思蘭的各組對應(yīng)試液1.0 mL。注射后0.5 h剪取豚鼠注射部位周邊皮膚，測量皮膚內(nèi)層藍(lán)斑直徑，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

結(jié)果：陽性對照組豚鼠藍(lán)色反應(yīng)斑直徑為(18.63±2.33)mm，均大于5 mm，為陽性；陰性對照組和注射用間苯三酚高、低劑量組豚鼠均未出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)斑，為陰性。

2.4 溶血性試驗

2%紅細(xì)胞混懸液的制備：抽取家兔心臟血約25 mL，立即放入含玻璃珠的干燥錐形瓶中不間斷振搖10 min，將纖維蛋白原除去，制成脫纖血液；將10 mL脫纖血液置離心管中，加生理鹽水40 mL，搖勻，離心10 min(1 000 r·min-1)，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再依上法進(jìn)行2～3次，直至上清液不顯紅色。將所得紅細(xì)胞用生理鹽水制成2%紅細(xì)胞混懸液。

試驗方法[3-6]：取干燥潔凈試管8支，1號為陰性對照管，2號為陽性對照管，3號為供試品對照管，4～8號為供試品管。按表1依次加入2%紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、純化水、間苯三酚(4 mg·mL-1)，混勻后立即置水浴鍋內(nèi)(37±0.5) ℃的，于第15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h觀察，并記錄實(shí)驗現(xiàn)象。

表1 溶血性試驗加樣方法

結(jié)果：陰性對照管無溶血及凝聚現(xiàn)象，陽性對照管發(fā)生溶血現(xiàn)象，溶液澄明紅色，管底幾乎未見紅細(xì)胞殘留；注射用間苯三酚各管未見溶血和凝聚發(fā)生，上清液無色澄明，管底下沉的紅細(xì)胞經(jīng)振搖后可均勻分散。置顯微鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)，注射用間苯三酚各管和陰性對照管紅細(xì)胞形態(tài)均正常。

2.5 血管刺激性試驗

取家兔4只，于耳緣靜脈注射給予受試物，采用同體左右側(cè)自身對比法[3-5]，左側(cè)注射葡萄糖注射液，右側(cè)注射間苯三酚10 mL·kg-1，給藥濃度為0.8 mg·mL-1)。每天1次，連續(xù)5 d。每次給藥前對動物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察，末次給藥后48、72、96 h同法觀察并記錄，取2只家兔的耳緣靜脈近心端血管2～3 cm供病理組織學(xué)檢查，另2只動物再觀察14 d后同法檢查，觀察刺激性反應(yīng)的可逆程度。

結(jié)果：根據(jù)肉眼觀察和病理組織學(xué)檢查的結(jié)果綜合判斷，家兔左右側(cè)注射部位皮膚、靜脈均呈現(xiàn)相似的變化，未見明顯充血、水腫、硬結(jié)及壞死等異?，F(xiàn)象，血管基本正常；病理組織學(xué)檢查無明顯異常，見圖1。

2.6 肌肉刺激性試驗

取家兔4只，試驗前24 h左右后肢內(nèi)側(cè)剃毛約3 cm×5 cm。于后肢股四頭肌內(nèi)注射受試物，采用同體左右側(cè)自身對比法[3-5]，左側(cè)注射葡萄糖注射液，右側(cè)注射間苯三酚32 mg·kg-1，給藥濃度為16 mg·mL-1，給藥容積均為每只5.0 mL。觀察給藥后注射局部的肌肉有無紅腫、充血等反應(yīng)。于注射后48 h取出家兔股四頭肌，觀察肌肉組織有無變化并做肌肉病理學(xué)檢查。

結(jié)果：在規(guī)定的時間內(nèi)觀察，注射局部肌肉未出現(xiàn)充血、紅腫、變性、壞死等反應(yīng)，左右側(cè)自身對比肌肉刺激反應(yīng)均為0級(即無明顯變化)，家兔肌肉基本正常；局部病理組織學(xué)檢查亦無明顯異常，見圖2。

A：給藥期空白對照組 B：給藥期受試藥物組C：恢復(fù)期空白對照組 D：恢復(fù)期受試藥物組圖1 鏡下血管觀察圖

A：空白對照組 B：受試藥物組圖2 鏡下肌肉觀察圖

3 討論

注射藥物安全性評價是藥物臨床前試驗研究的重要組成部分，注射劑產(chǎn)品在臨床使用的風(fēng)險性較高，與其他劑型比較，更需加強(qiáng)安全性的技術(shù)要求和風(fēng)險控制。臨床前藥理毒理研究是藥物臨床前試驗的非常重要的組成部分，為臨床安全合理用藥及新藥注冊提供參考。其中一項重要內(nèi)容是藥物過敏性、溶血性和刺激性試驗。本試驗受試藥物的劑量按照注射用間苯三酚臨床使用劑量和人與受試動物等效劑量設(shè)計，能夠反映出藥物使用中出現(xiàn)的可能不良反應(yīng)。過敏性試驗中綜合預(yù)實(shí)驗結(jié)果，即劑量為66.7 mg·kg-1時，動物均未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。因此，高劑量組致敏劑量設(shè)計為33.3 mg·kg-1，即人臨床使用等效劑量2倍，激發(fā)劑量則為4倍，溶血性試驗劑量設(shè)計為人臨床使用等效劑量的5倍，肌肉刺激性試驗為4倍，血管刺激試驗與人臨床使用等效劑量相同，均不低于臨床擬用濃度。

目前注射用間苯三酚臨床使用較為廣泛，主要用于婦產(chǎn)科流產(chǎn)[7-8]、胃腸道疼痛[9-11]、腎絞痛[13]等疼痛的緩解，多與其他藥物聯(lián)合使用。目前臨床資料顯示其不良反應(yīng)發(fā)生率低。秦?zé)樀萚12]將242例晚期流產(chǎn)的患者分為兩組，分別使用間苯三酚和硫酸鎂進(jìn)行療效和不良反應(yīng)的比較，結(jié)果顯示間苯三酚起效時間快、治療療程短、保胎成功率高，明顯優(yōu)于硫酸鎂，而不良反應(yīng)發(fā)生率僅為4.13%，明顯低于對照組的29.75%。郝丹[13]將100例腎絞痛患者分為兩組，分別使用山莨菪堿和間苯三酚進(jìn)行治療，結(jié)果間苯三酚組總有效率為98%，而山莨菪堿組為88%，間苯三酚組不良反應(yīng)發(fā)生率為10%，明顯低于山莨菪堿組的24%。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射用間苯三酚對豚鼠無致敏性，溶血性試驗中未引起紅細(xì)胞溶血和凝聚，對家兔血管、肌肉無刺激性。說明注射用間苯三酚起效快、不良反應(yīng)少、安全可靠，具有較高的臨床使用優(yōu)勢及前景。

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[13]郝丹.間苯三酚治療腎絞痛的臨床療效分析[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2016,24(9):90-91.

Nonclinical Safety Evaluation of Phloroglucinol Dehydrate Injection

WANG Xin1, ZHOU Ji-chun1, JING Ai-Hua2, LEI Wan-jun2

(1.Henan Provincial Institute of Food and Drug Control, Zhengzhou 450008,China;2.School of Medical Technology and Engineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

ObjectiveTo evaluate the preclinical animal safety of phloroglucinol dehydrate injection.MethodsActive systemic anaphylaxis was investigated in guinea pigs when phloroglucinol dehydrate injection was injected on 14 d and 21 d after the first treatment．Passive cutaneous anaphylaxis was investigated in guinea pigs by intravenous injection of evans blue at 24 h after intracutaneous injection of serum antibodies for observing blue reaction spots. In the in vitro hemolytic test，hemolysis and coagulation were observed in 3 h．In the vessel stimulation test，the local blood vessel stimulation was observed after injecting phloroglucinol dehydrate injection for successively 5 d．In the muscle stimulation test, the muscular tissue stimulation was observed after injecting phloroglucinol dehydrate injection in the rabbit hind leg quadriceps.ResultsThere was no allergic reaction to the guinea pigs，no hemolytic and coagulation reaction in the hemolytic test and no stimulation to ear vein and muscular tissue in the vessel and muscle stimulation test.ConclusionPhloroglucinol dehydrate injection was safe and reliable without allergic reaction, stimulation response and haemolyticus.

phloroglucinol dehydrate injection；safety test；allergic reation；hemolytic test；stimulation test

1672-688X(2017)02-0100-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.006

2017-03-17

1.河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州 450008 2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽 471023

王欣(1978—)，女，河南柘城人，主管藥師，從事藥品檢驗藥理方面研究。

R965.3

A