彭靜華，張育德，張鴻日，閆俊強(qiáng)

過表達(dá)BCL-2對急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的影響

彭靜華，張育德，張鴻日，閆俊強(qiáng)

目的 探討采用慢病毒介導(dǎo)BCL-2在急性腦梗死大鼠腦組織過表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡基因的影響。方法 45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和觀察組。假手術(shù)組大鼠只分離血管不插入線栓，后兩組采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型。假手術(shù)組和模型組分別于手術(shù)前10 d通過顱內(nèi)動(dòng)脈給予慢病毒空載體，觀察組給予慢病毒BCL-2過表達(dá)載體。在線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型72 h后，分析大鼠腦組織中凋亡相關(guān)基因(caspase-3,Bax)的表達(dá)以及腦細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 慢病毒介導(dǎo)的BCL-2表達(dá)質(zhì)粒可在大鼠腦組織中表達(dá)。觀察組大鼠腦組織中BCL-2的水平明顯高于假手術(shù)組和模型組。與假手術(shù)組相比，模型組、觀察組大鼠腦組織caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)，觀察組大鼠腦組織中caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯降低(均P<0.05)，但仍顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和觀察組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加(均P<0.05)。結(jié)論 過表達(dá)BCL-2可降低大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)，降低凋亡水平，對神經(jīng)具有一定保護(hù)作用。

腦梗死；BCL-2；細(xì)胞凋亡；caspase-3；Bax；大鼠

急性腦梗死具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病類型之一[1]。急性腦梗死腦組織血液供應(yīng)發(fā)生障礙，導(dǎo)致局部腦組織因缺血發(fā)生壞死、軟化，在缺血中心不可逆壞死區(qū)域與正常腦組織之間存著缺血半暗帶區(qū)，該區(qū)域的組織在功能上呈現(xiàn)可逆性損害，這部分神經(jīng)細(xì)胞仍呈現(xiàn)正常的組織結(jié)構(gòu)，但是在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)[2]。而細(xì)胞的凋亡則是由基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過程，其中BCL-2是一個(gè)重要的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，其由239個(gè)氨基酸組成，在抑制細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用[3]。目前研究顯示BCL-2基因和蛋白在急性腦梗死腦組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致BCL-2家族成員Bax形成同源二聚體，使腦梗死細(xì)胞凋亡水平明顯增加，加劇了腦梗死神經(jīng)功能的損傷程度[4]。通過抑制腦梗死半暗帶細(xì)胞的凋亡，則可達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。本研究采用慢病毒介導(dǎo)BCL-2載體，探討B(tài)CL-2在急性腦梗死大鼠腦組織特異性高表達(dá)，對大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料 SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g)購自上海斯萊克動(dòng)物中心，HRP-羊抗鼠二抗購自北京中杉有限公司，Triozol購自Invitrogen公司，BCL-2、caspase-3和Bax鼠單克隆抗體購自美國Santa公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司。

1.2 急性腦梗死大鼠模型構(gòu)建 采用LONGA的方法[5]建立大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型。在手術(shù)后2 h內(nèi)大鼠表現(xiàn)出精神萎靡、同側(cè)霍納氏癥、對側(cè)前肢下垂、內(nèi)收內(nèi)旋并自發(fā)性向患側(cè)轉(zhuǎn)圈說明建模成功。若無此表現(xiàn)說明構(gòu)建模型失敗，則剔除該大鼠。實(shí)驗(yàn)分為3組：假手術(shù)組、模型組和觀察組，每組15只。假手術(shù)組大鼠只分離血管不插線栓，假手術(shù)組和模型組分別于手術(shù)前10 d通過顱內(nèi)動(dòng)脈給予慢病毒空載體(GC-FU-BCL-2)，觀察組給予慢病毒BCL-2過表達(dá)載體(GC-FU-EGFP)。

1.3 caspase-3和Bax蛋白的變化 大鼠建模72 h立即取出腦組織，置于液氮中，采用研缽將組織研碎，然后置于1×loading buffer中在100 ℃金屬浴中煮沸10 min，樣品12 000 r·min-1離心5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉，然后用caspase-3和Bax一抗包被過夜，PBST洗滌3次，然后用HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗室溫包被1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，然后加發(fā)光液，顯色，拍照。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參，采用灰度計(jì)算軟件分析目的蛋白條帶灰度，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 TUNEL分析腦組織細(xì)胞凋亡水平 大鼠建模72 h后處死大鼠，腦組織采用OCT包埋，然后采用冰凍切片機(jī)將腦組織切成厚度為7 μm的切片，黏附于玻片上。然后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。大體操作流程如下：玻片采用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定，用2 mg·mL-1的Proteinase K溶液處理玻片，然后滴加100 μL1×Equilibration Buffer于標(biāo)本區(qū)域，孵育30 min后棄液體，在玻片上滴加50 μL TdT孵育緩沖液。37 ℃孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min，用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。立即在熒光顯微鏡下分析樣本。觀察時(shí)標(biāo)本放大400倍，隨機(jī)選取梗死區(qū)周邊的區(qū)域10個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例作為腦細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 BCL-2表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組和模型組比較，觀察組大鼠經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的BCL-2載體在腦組織中表達(dá)高水平的BCL-2蛋白。對3組大鼠腦組織中BCL-2蛋白的水平分析顯示：觀察組(0.936±0.218)大鼠腦組織中BCL-2的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(0.390±0.118)和模型組(0.345±0.191)(P<0.05)，見圖1。

①與模組比較，P<0.05；②與假手術(shù)組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦組織BCL-2表達(dá)B：3組大鼠腦組織BCL-2表達(dá)定量分析圖1 3組大鼠腦組織中BCL-2蛋白的表達(dá)水平變化

2.1 不同處理組大鼠腦組織中caspase-3和Bax水平比較 與假手術(shù)組(0.225±0.179)比較，模型組(1.211±0.338)和觀察組(0.585±0.216)大鼠腦組織中caspase-3的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與假手術(shù)組(0.303±0.207)比較，模型組(1.500±0.408)和觀察組(0.782±0.310)大鼠腦組織中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。而在慢病毒介導(dǎo)的BCL-2高表達(dá)的大鼠中，其腦組織中caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯下降(P<0.05)，見圖2。

①與假手術(shù)組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦組織caspase-3和Bax蛋白表達(dá)情況B：3組大鼠腦組織Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)定量分析圖2 3組大鼠腦組織中Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平變化

2.2 3組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較 大鼠建模后72 h腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死范圍明顯增加，而在過表達(dá)BCL-2的大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，(如圖3A所示)。對凋亡水平進(jìn)行定量分析顯示，與假手術(shù)組(2.95±1.93)比較，模型組(41.05±3.58)大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)。而觀察組(12.84±2.32)大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組(41.05±3.58)則顯著性下降(P<0.05)，但是其水平仍然顯著高于假手術(shù)(2.95±1.93)組(P<0.05)(如圖3B)。

①與假手術(shù)組比較，P<0.05。A：3組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況 (TUNEL熒光染色 x400)B：3組大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)變化圖3 3組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)情況比較

3 討論

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理或者病理?xiàng)l件下，由許多基因精密調(diào)控的程序化死亡過程，是細(xì)胞維持自我穩(wěn)定的重要機(jī)制[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死過程中半暗帶區(qū)域細(xì)胞凋亡是治療急性腦梗死的關(guān)鍵，這部分細(xì)胞具有可逆性，可通過抑制細(xì)胞凋亡使其恢復(fù)功能。因此有效抑制該區(qū)域細(xì)胞的凋亡對降低腦組織細(xì)胞凋亡，降低神經(jīng)功能損傷具有重要的意義[7]。BCL-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控中主要的調(diào)控蛋白，是主要的凋亡抑制蛋白。研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死BCL-2的表達(dá)水平明顯下降，說明機(jī)體抗凋亡能力下降，細(xì)胞凋亡的穩(wěn)態(tài)被打破[8]。因此通過重建腦組織中凋亡穩(wěn)態(tài)環(huán)境，可能抑制腦梗死半暗帶區(qū)域細(xì)胞的凋亡，對腦組織起到保護(hù)作用。

本研究采用慢病毒介導(dǎo)BCL-2在大鼠腦組織中過表達(dá)BCL-2，Western bolt顯示觀察組大鼠腦組織中BCL-2的表達(dá)水平明顯增加，說明采用慢病毒作為傳輸載體可實(shí)現(xiàn)BCL-2在腦組織中的過表達(dá)。本研究進(jìn)一步論證了過表達(dá)BCL-2對大鼠其他凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡直接介導(dǎo)者，其激活依賴于cyt-c的釋放，而BCL-2家族包括BCL-2可通過線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)的釋放[9-10]。目前研究證實(shí)急性腦梗死大鼠和患者腦組織或外周血中caspase-3和Bax水平明顯升高[11-12]。BCL-2可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，本研究發(fā)現(xiàn)BCL-2高表達(dá)后大鼠腦組織中caspase-3和Bax蛋白水平較模型組顯著下降，說明BCL-2高表達(dá)具有抑制大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的作用。這一現(xiàn)象通過TUNEL染色得到了進(jìn)一步的確認(rèn)。

綜上所述，急性腦梗死大鼠腦組織高表達(dá)BCL-2可顯著減少凋亡相關(guān)基因caspase-3和Bax的表達(dá)，抑制腦細(xì)胞凋亡，為急性腦梗死治療藥物研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Effects of BCL-2 Overexpression on Neuronal Apoptosis and Related Genes in Rats with Acute Cerebral Infarction

PENG Jing-hua, ZHANG Yu-de, ZHANG Hong-ri, YAN Jun-qiang

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo investigate the effects of BCL-2 overexpression mediated bylentivirus on neuronal apoptosis and related genes in rats with acute cerebral infarction.Methods45 rats were randomly divided into sham group (only isolated vascular suture unplugged), model group and observation group. At 10 days before operation, rats in sham group and model group were treated with empty vector mediated by lentiviral;rats in observation group were treated with BCL-2 overexpression mediated by lentivirus null carrier. After middle cerebral artery infarction model were constructed at 72 h， the caspase-3, BCL-2, Bax protein apoptosis index of rat brain were analyzed.ResultsBCL-2 protein mediated by lentivirus could be expressed in rat brain. BCL-2 protein levels in observation group was significantly higher than that of sham group and model group(allP<0.05). Caspase-3 and Bax protein levels in model group was significantly higher than that of sham group(allP<0.05), while caspase-3 and Bax protein levels in observation group were significantly lower than that of model group(allP<0.05) , but it were significantly higher than that of sham group(allP<0.05). Apoptosis in model group and observation group was significantly higher than that of sham group (allP<0.05).ConclusionOverexpression of BCL-2 could reduce the level of apoptosis in rat of acute cerebral infarction and have a protective effect on brain.

cerebral infarction；BCL-2；apoptosis；caspase-3；Bax；rat

1672-688X(2017)02-0085-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.002

1.國家自然科學(xué)基金(U1304809) 2.河南洛陽市青年醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新聯(lián)合專項(xiàng)資金項(xiàng)目(1503008A-15)

2017-04-12

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

彭靜華(1980—)，女，河南洛陽人，主治醫(yī)師，從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作。

張鴻日，男，副主任醫(yī)師，E-mail：hongrizhang@126.com

R743.33

A