王 丹，周美亮，李金博， 孫占敏，吳燕民(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 7000； .中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東 深圳 518040)

植物生產(chǎn)層

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在草類植物中的應(yīng)用

王 丹1,2，周美亮2，李金博3， 孫占敏2，吳燕民1,2
(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東 深圳 518040)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代基因組編輯技術(shù)，一經(jīng)問世就受到廣泛關(guān)注。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有對特定基因位點進(jìn)行精確修飾(包括敲除、插入、替換等)的強(qiáng)大功能，同時具有操作簡單、效率高、適應(yīng)性廣等技術(shù)優(yōu)勢，目前已在微生物、植物、動物以及人類基因治療等整個生命科學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。本文簡要介紹了CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展歷程、作用機(jī)理、技術(shù)優(yōu)勢、功能及應(yīng)用領(lǐng)域，總結(jié)該技術(shù)在植物領(lǐng)域的基因組定向編輯中的研究進(jìn)展。并提出了這項技術(shù)在草類植物基因功能分析、基因代謝調(diào)控途徑與遺傳改良等方面的應(yīng)用前景，為相關(guān)領(lǐng)域的研究工作奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9；基因組編輯；草類植物；定點敲除；基因功能；遺傳改良

基因編輯(genome editing)是可以對基因組進(jìn)行定點修飾的一種技術(shù)，是研究特定基因功能的基礎(chǔ)。近年來，基因組編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)。這兩種人工核酸酶的原理都是通過DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域融合, 在靶位點將DNA切斷。而CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系統(tǒng)作為新一代基因組編輯技術(shù)，一經(jīng)問世就受到人們的高度關(guān)注和極大反響[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種抵御病毒侵襲的免疫防御系統(tǒng)，通過將入侵噬菌體和DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPR RNAs(crRNAs)來指導(dǎo)同源序列的降解，對抗入侵的病毒及外源DNA[2]，科學(xué)家們利用sgRNA識別特定序列引導(dǎo)Cas9蛋白切割原理，通過對CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造，對特定基因位點進(jìn)行敲除、插入和替換等精確編輯。因其操作簡單、重組效率高、靶位點選擇具有廣泛性、同時可針對多個基因進(jìn)行編輯、具有廣泛的物種適應(yīng)性及試驗周期短、成本低等優(yōu)勢，受到研究者的青睞[3]。CRISPR/Cas9體系可進(jìn)行探究基因功能，對目標(biāo)生物的基因組進(jìn)行特異性的基因編輯，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，幾乎涉及到原核生物、動植物基因編輯與人類基因治療等整個生物界[4-5]。CRISPR/Cas9體系目前已在多種植物中開展了基因組編輯相關(guān)研究，但在草業(yè)領(lǐng)域的研究應(yīng)用尚處于起步階段，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效地開展基因功能研究，發(fā)掘優(yōu)良基因，進(jìn)行代謝調(diào)控研究，探明代謝調(diào)控機(jī)理，進(jìn)行有針對性的基因敲除和優(yōu)良基因的定點整合和多個優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的聚合，將為草業(yè)領(lǐng)域基因遺傳改良研究帶來突破性進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展歷程

1987年Ishino等[6]在對一種細(xì)菌的堿性磷酸酶基因進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)一段串聯(lián)的短回文重復(fù)結(jié)構(gòu)。1993年，Mojica等[7]在極端耐鹽的古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一段具有30個堿基并被36個堿基隔開的重復(fù)回文序列，與已知的微生物的重復(fù)序列家族都不具有一致性，推測這些存在于古細(xì)菌中的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)可能具有重要功能[8]。截至2000年，先后在20余種不同的細(xì)菌和古細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)組成與CRISPR類似的序列[9]， 2002年這種結(jié)構(gòu)正式被命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)，即CRISPR，并預(yù)測這種特殊的重復(fù)序列發(fā)揮著至關(guān)重要的生物學(xué)功能[10]。2005年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一部分細(xì)菌的CRISPR中的間隔序列與細(xì)菌病毒基因組序列信息高度一致，并推測這一序列可能參與了應(yīng)對噬菌體入侵的免疫防御[11]。2007年，嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接參與細(xì)菌對噬菌體的免疫反應(yīng)被證明[12]。2008年，驗證CRISPR能直接干擾DNA阻止外源質(zhì)粒在表皮葡萄球菌的轉(zhuǎn)移[13]，證明Cas9蛋白是抵抗病毒的基礎(chǔ)[14]。2009年，揭示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過Cas9蛋白識別外源RNAs，然后進(jìn)行干擾或切割阻止其表達(dá)，阻止病毒和其它原核生物入侵[15]。2011年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制被闡述[16]，同時推測Cas9、tracrRNA(trans-activating crRNA)和crRNA共同作用降解與crRNA互補(bǔ)的外源DNA分子[17]。2012年，Charpentier和Doudna兩位科學(xué)家使用重組Cas9和體外轉(zhuǎn)錄的crRNA證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對特定的DNA位點進(jìn)行切割，提出可利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯[18]。2013年，驗證CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人和小鼠進(jìn)行基因組編輯的可行性[19]，并首次證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠用于植物進(jìn)行基因組定點編輯[20]，并發(fā)表了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能有效的進(jìn)行基因定點沉默，可同時調(diào)控多個基因，該技術(shù)適用于基因組編輯、多種生物醫(yī)學(xué)研究、基因組功能分析和微生物代謝工程等[21]。此后人們應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域開展了大量的研究工作，其強(qiáng)大的功能和應(yīng)用領(lǐng)域被逐步開拓。

1.2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中[22]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核心部分包括基因組(染色體或質(zhì)粒)中的CRISPR陣列和Cas9蛋白，CRISPR陣列由一個前導(dǎo)序列(leader)和重復(fù)序列(repeats)及來源于病毒或質(zhì)粒等外源DNA的間隔序列(spacer)相間組成，外源DNA的間隔序列前體(protospacer)側(cè)翼有一段保守短序列，即間隔序列前體旁基序PAM(protospacer adjacent motif)，是獲取DNA片段所需的識別序列。CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于sgRNA與靠近PAM(NGG)處10～12 bp堿基的配對。Cas9蛋白往往與CRISPR位點的重復(fù)序列相連，是一類較大的多態(tài)性家族，包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和RNA結(jié)合蛋白等，具有核酸相關(guān)的功能域。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中當(dāng)噬菌體病毒或質(zhì)粒入侵時，系統(tǒng)會將噬菌體的一段DNA序列重組并整合到CRISPR 5′端的兩個重復(fù)序列之間，當(dāng)病毒再次入侵時，系統(tǒng)將能夠識別入侵者攜帶的外源核酸中的特殊片段，CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄生成 crRNA與系統(tǒng)編碼tracrRNA結(jié)合形成向?qū)NA(single guide RNA, sgRNA)，sgRNAs與Cas9蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物特異性識別并整合入侵噬菌體的DNA序列后，Cas9蛋白具有核酸內(nèi)切酶的活性，可將與crRNA互補(bǔ)的雙鏈DNA切割，形成雙鏈斷裂，導(dǎo)致入侵噬菌體或質(zhì)粒DNA降解，抵御入侵的病毒及外源DNA，提供免疫防御[23-25]。

科學(xué)家們依據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌體內(nèi)的免疫防御原理，通過人工改造sgRNA 和Cas9蛋白，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯研究(圖1)，設(shè)計sgRNA序列依據(jù)識別靶基因序列(coding sequence, CDS) 區(qū)域達(dá)到精確定位功能，將設(shè)計好的sgRNA序列與Cas9蛋白構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，先進(jìn)行基因組靶位點識別，CRISPR/Cas9系統(tǒng)與目標(biāo)DNA結(jié)合后，直接參與目標(biāo)DNA的解旋和對DNA的切割使雙鏈斷裂，然后激發(fā)生物體本身的修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)過程中會產(chǎn)生堿基的缺失或插入，造成DNA的突變[26]，結(jié)合人工設(shè)計修復(fù)模板，完成基因組的定點敲除、插入、替換引入外源基因等操作。隨著研究的不斷深入開展，該項技術(shù)將會更加高效地應(yīng)用在與基因組編輯相關(guān)的研究中。

1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代的基因組編輯技術(shù)，表現(xiàn)出許多優(yōu)越性：1) 實驗操作簡便、周期短、成本低，只需設(shè)計sgRNA就可以靶向不同的位點，針對基因的編碼區(qū)構(gòu)建出功能缺失突變體，開展基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的研究[27]。2) 系統(tǒng)靶向精確性更高，更具有可控性。通過改變sgRNA的序列實現(xiàn)對基因的特異性修飾，較短的sgRNA序列使CRISPR/Cas9的切割效率更高?？梢酝ㄟ^對Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來的染色體變異風(fēng)險[28-29]。3) 靶位點選擇的廣泛性，CRISPR/Cas9要求靶位點序列在生物基因組中廣泛存在，使得該項技術(shù)幾乎可以應(yīng)用到所有物種進(jìn)行基因組編輯[30]。4) CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以同時對靶基因的不同位點進(jìn)行編輯，也可以同時針對多個基因進(jìn)行編輯[31]，其在基因操作中的優(yōu)勢也比較明顯。5) 應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因修飾可遺傳，具有直接獲得純合子的可能，可同時對兩個位點切割，然后在單鏈DNA模板的介導(dǎo)下進(jìn)行同源重組，在兩個位點同時編輯[32]，縮短試驗周期。6) CRISPR/Cas9系統(tǒng)可獲得沒有篩選基因、報告基因等外源基因的轉(zhuǎn)基因植物，外源插入基因可以在后代的分離中很容易與靶突變位點發(fā)生分離，從而獲得無篩選基因的遺傳改良作物[33]，大大提高人們對轉(zhuǎn)基因作物的接受程度。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram describing the working principle of the CRISPR/Cas9 system

注：根據(jù)文獻(xiàn)[4]和[25]整理而成。

Note: Modified by reference [4] and [25].

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能及應(yīng)用領(lǐng)域

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于基因位點各種修飾方式，包括基因敲除、基因修復(fù)、同源重組、定點整合、大片段刪除以及多基因同時敲除蛋白質(zhì)定位、抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄及表觀基因組編輯等，隨著研究的深入，更多的功能將會被開發(fā)利用[34]。CRISPR/Cas9作為RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)，因其強(qiáng)大的功能，在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域均能展開相關(guān)的應(yīng)用研究。

2.1 微生物領(lǐng)域

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是從細(xì)菌抗噬菌體病毒系統(tǒng)中演變而來，通過對CRISPR/Cas9系統(tǒng)有針對性地編輯微生物基因組靶向殺死野生型細(xì)胞，已成功應(yīng)用于肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)[35]和大腸桿菌(Escherichiacoli)[36]，同時開展了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等位基因的置換[37]，提高了乳酸桿菌(Lactobacillus)潛在應(yīng)用價值研究[38]，對病毒基因組展開全面系統(tǒng)研究[39]，伴隨CRISPR/Cas9系統(tǒng)的深入研究，該項技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用將全面展開。

2.2 動物領(lǐng)域

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因組進(jìn)行精確編輯，有效提高了研究效率，而且大大縮短了育種年限。目前CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因靶向修飾成功地應(yīng)用于多種動物研究應(yīng)用，在模式動物秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)[40]、果蠅(Drosophilamelanogaster)[41]、斑馬魚(Daniorerio)[42]、爪蟾(Xenopuslaevis)[43]、小鼠(Musmusculus)[44]、大鼠(Rattusnorvegicus)[45]中采用Cas9-sgRNA技術(shù)實現(xiàn)靶基因的定點敲除和修飾。CRISPR/Cas9技術(shù)將構(gòu)建的Cas9 mRNA/sgRNA注射受精卵，可以高效地獲得基因敲除的豬(Susscrofa)[46]，成功獲得了肌肉生長抑制素MSTN(Myostatin)基因敲除的綿羊(Ovisaries)[47]，并建立在活體動物細(xì)胞中觀察特定基因座的方法[48]。此外在兔(Oryctolaguscuniculus)[49]、猴(Macacamulatta)[50]等動物中也獲得了應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功進(jìn)行基因敲除的報道。

2.3 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用基因治療

當(dāng)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)誕生，人們就開始探討這項技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，嘗試應(yīng)用同源介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制，將正確的序列引入細(xì)胞中替代突變的序列，進(jìn)行基因修復(fù)，以此達(dá)到基因治療的目的。應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)研究在活細(xì)胞中有效激活基因，促進(jìn)對整個基因組的功能篩選以及特定疾病的基因鑒定[51]。應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建小鼠癌癥模型[52]，人干細(xì)胞阿爾茨海默病模型[53]，加速對病癥的研究工作。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)肝細(xì)胞中Fah突變基因[54]，修復(fù)囊腫性纖維化跨膜傳導(dǎo)受體基因[55]、腫瘤基因敲除[56]、遺傳疾病缺陷基因的修復(fù)[57]，在逆轉(zhuǎn)錄病毒和DNA病毒感染引起的疾病[58]，應(yīng)用性抗菌藥物[59]等方面都開展了相關(guān)研究，并取得一定的進(jìn)展。

2.4 植物領(lǐng)域

應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因組的原位實現(xiàn)對基因的定點突變、定點整合、基因置換及基因修復(fù)等，是植物遺傳改良和分子設(shè)計的理想途徑。通過基因的定點突變與置換，獲得目標(biāo)性狀的遺產(chǎn)改良，可以避免轉(zhuǎn)基因表達(dá)的不可控性和食品安全顧慮，是一種比較理想和高效的作物遺傳改良方法。通過CRISPR/Cas9能更加快速高效的實現(xiàn)植物性狀的改良，對植物基因功能的研究與應(yīng)用具有重要的意義。目前已經(jīng)在包括模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)，以及重要農(nóng)作物水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticamaestivum)等在內(nèi)的多種植物中開展基因組定點編輯研究(表1)。

2.4.1 擬南芥 CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于模式植物擬南芥，開展了對綠色熒光蛋白報告基因GFP(green fluorescent protein)和乙醇脫氫酶基因ADH1(alcohol dehydrogenase 1)位點突變研究，通過對T2、T3代穩(wěn)定遺傳性檢測表明：其突變效果穩(wěn)定且符合孟德爾遺傳定律[60-61]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對擬南芥赤霉素應(yīng)答基因GAI(gibberellic acid insensitive)，脅迫應(yīng)答基因JAZ1(jasmonate-zim-domain protein1)，油菜素內(nèi)脂受體基因BRI1(brassinosteroid insensitive 1)，鎂螯合酶基因CHLI(magnesium chelatase subunit 1)，種皮顏色調(diào)控基因TT4(transparent testa 4)等不同基因的12個靶位點進(jìn)行編輯，在T2代中單個突變植物后代發(fā)現(xiàn)約22%的單株為純合體[62]，誘導(dǎo)擬南芥ADH1和TT4基因位點，結(jié)果均能有效誘導(dǎo)同源修復(fù)途徑發(fā)生的突變[63]，對卵細(xì)胞特異性啟動子EC1.2(egg cell-specific gene)相關(guān)基因位點進(jìn)行編輯研究，實現(xiàn)多基因的突變[64]。

2.4.2 煙草 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在煙草中的應(yīng)用，構(gòu)建靶向番茄紅素脫氫酶PDS(phytoene desaturase)基因位點的Cas9/sgRNA，采用RE-PCR方法分析，結(jié)果表明突變率為1.8%～2.4%[65]。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除煙草的兩個轉(zhuǎn)錄因子基因PDS和PDR6，插入或缺失頻率約16.2%～20.3%[66]，在靶向報告基因GUS(β-glucuronidase, GUS)、番茄紅素脫氫酶NbPDS、戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合酶基因NbIspH等的編輯研究中，也證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功應(yīng)用于煙草[67]。

表1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在不同植物種中的應(yīng)用研究Table 1 Studies on the application of CRISPR/Cas9 system in different plant species

2.4.3 水稻 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中實現(xiàn)了抗性相關(guān)基因ROC5(rice outermost cell-specific gene 5)、葉綠體加工酶基因SPP(stromal processing peptidase)、葉綠體發(fā)育基因YSA(young seedling albino)[68]和周期蛋白依賴性激酶基因CDK(cyclin-dependent kinase)[69]等基因的定點突變。針對兩個水稻亞種中的基因敲除標(biāo)記基因OsPDS(phytoene desaturase gene)、OsPMS3(theOsPMS3 gene codes a noncoding RNA)、OsEPSPS(a key enzyme in the pathway for aromatic amino acid synthesis)，轉(zhuǎn)錄因子OsDERF1、OsMYB5、OsMYB1和逆境應(yīng)答相關(guān)基因OsMSH1(DNA mismatch repair protein)、OsROC5、OsSPP、OsYSA等10個靶標(biāo)基因進(jìn)行定點突變，獲得轉(zhuǎn)基因株系中突變率為44.4%，其中7.7%為純合系[70]。針對水稻除草劑抗性基因BEL(bentazon sensitive lethal gene)設(shè)計3個不同gRNAs，結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變效率在2%～16%，表型分析顯示轉(zhuǎn)基因植物對除草劑苯達(dá)松敏感[71]。通過構(gòu)建3個與水稻脅迫應(yīng)答相關(guān)基因OsMPK5不同位點配對的Cas9/gRNAs發(fā)現(xiàn),gRNA與靶標(biāo)DNA的配對位置是決定Cas9/gRNA打靶特異性的關(guān)鍵因素[72]。Xie等[73]構(gòu)建多個tRNA-gRNA多順反子PTG(polycistronic tRNA-gRNA gene) 基因，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得了穩(wěn)定的水稻轉(zhuǎn)基因株系。

2.4.4 小麥 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小麥中的應(yīng)用，靶向脂氧合酶基因TaLox2(lipoxygenase)，獲得穩(wěn)定的基因突變株系[74]，靶向EST(expressed sequence tags)基因，結(jié)果表明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可減少小麥植酸含量[75]，對MLO(mildew-resistance locus)基因位點進(jìn)行突變，獲得了抗白粉病的特性小麥[76]，對報告基因inox(inositol oxygenase)和pds(phytoene desaturase)基因不同位點的研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時對一個基因不同位點及不同的兩個基因進(jìn)行編輯[77]。

2.4.5 玉米 應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，獲得兩個靶向植酸合成的關(guān)鍵酶基因ZmIPK(important phytic acid kinese)的玉米，突變率分別為16.4%和19.1%[78]。靶向高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HKT(high-affinity potassium transporter)，在玉米原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)基因玉米植株中穩(wěn)定遺傳的突變體[79]。

2.4.6 大豆 在應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對大豆進(jìn)行靶向基因組編輯試驗中，分別應(yīng)用大豆GmU6和擬南芥AtU6啟動子突變Glyma06g14180(predicted 11 U6 genes in soybean),Glyma08g02290和Glyma12g37050基因，結(jié)果表明，使用大豆GmU6啟動子的打靶效率明顯高于使用擬南芥AtU6啟動子的打靶效率[80]。Jacobs等[81]構(gòu)建了針對GFP的5′和3′的兩個CRISPR/Cas9載體，結(jié)果表明，針對5′的效率遠(yuǎn)高于3′而且突變頻率隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。

2.4.7 高粱 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建應(yīng)用Y158載體，包含U6啟動子、靶向紅色熒光蛋白基因DsRED2(red fluorescent protein)的5′端，針對高粱幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果獲得穩(wěn)定表達(dá)[82]。

2.4.8 馬鈴薯 通過構(gòu)建含有U6啟動子，sgRNA靶向編碼IAA蛋白的StIAA2(encoding an Aux/IAA protein)基因的載體，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除馬鈴薯StIAA2基因，獲得突變體，在T1中發(fā)現(xiàn)純合子，表明應(yīng)用該系統(tǒng)可進(jìn)行馬鈴薯基因編輯相關(guān)研究[83]。

2.4.9 番茄 Brooks等[84]建構(gòu)了兩個sgRNAs敲除番茄花器官發(fā)育相關(guān)基因SlAGO7，獲得轉(zhuǎn)基因突變植株，對轉(zhuǎn)基因后代分析顯示CRISPR/Cas9在番茄中誘導(dǎo)的突變能夠穩(wěn)定遺傳給后代。

2.4.10 甜橙 CRISPR/Cas9在甜橙中應(yīng)用突變PDS基因，檢測突變頻率在3.2%～3.9%，為今后利用該技術(shù)進(jìn)行柑橘的品種改良奠定了基礎(chǔ)[85]。

2.4.11 楊樹 通過分析不同sgRNA結(jié)合毛白楊pds靶基因DNA序列后對突變效率的影響，其中3′端的堿基配對更為重要。利用該技術(shù)，獲得多個楊樹轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)構(gòu)基因的敲除突變體株系，為將來開展基因功能研究和楊樹遺傳改良奠定了基礎(chǔ)[86]。

2.4.12 地錢 Sugano等[87]構(gòu)建針對生長素正調(diào)控因子ARF1(auxin response factor)基因的sgRNA，轉(zhuǎn)化地錢殼孢子，在T1代中檢測突變率為11.1%，這些突變能夠以胞芽無性生殖的方式穩(wěn)定遺傳給后代。

在開展基礎(chǔ)研究的同時，也開展了針對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和提高效率等研究，Johnson等[91]通過設(shè)計12個不同的sgRNA，評估CRISPR/Cas9系統(tǒng)效率，探索優(yōu)化設(shè)計方案，Lei等[92]提供了一個26種植物設(shè)計sgRNA和檢測脫靶位點的開放的網(wǎng)絡(luò)平臺，這些都促進(jìn)了該項技術(shù)在植物中的應(yīng)用效率。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在草類植物中的應(yīng)用前景

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在草類植物基因功能、基因代謝及表達(dá)調(diào)控、遺傳改良等研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 基因功能研究

應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯研究，針對豐富的草類植物種質(zhì)資源開展基因組學(xué)研究，可全面深入地挖掘基因功能，獲得重要的遺傳信息。Wang等[88]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對豆科模式植物百脈根(Lotusjaponicas)共生固氮SNF(symbiotic nitrogen fixation)相關(guān)基因進(jìn)行編輯研究，建構(gòu)以SYMRK(symbiosis receptor-likekinase)基因為靶向的SYMRK-sgRNA，獲得突變植株，加快了SNF相關(guān)基因功能的研究。草類植物資源豐富，生態(tài)適應(yīng)性廣泛，在各種極端生境中都有生長，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)將促進(jìn)發(fā)掘一些在極端生境中生長的鄉(xiāng)土草品種的特殊性狀基因，如在沙漠中生長的草類的耐旱基因，在鹽堿地生長的草類植物的耐鹽堿基因，在高海拔環(huán)境生長的草類植物的耐寒、耐貧瘠基因等等。開展草類植物優(yōu)良基因質(zhì)源的收集，實現(xiàn)優(yōu)良基因的高效利用。

3.2 基因代謝及表達(dá)調(diào)控研究

應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)加速了科學(xué)家們探明基因代謝途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的腳步，可獲得多個基因定點敲除、插入等突變，實現(xiàn)基因組水平上的基因改造、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與表觀遺傳調(diào)控[93]。Meng等[90]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功對豆科模式牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的PDS基因進(jìn)行定點敲除，并在T0代得到10.35%的純合敲除突變體，為苜蓿等豆科牧草的功能基因組學(xué)研究提供了新的研究工具。據(jù)此，可通過設(shè)計突變同一個代謝通路上的靶基因，通過進(jìn)行不同基因功能缺失突變，建立功能基因的突變體庫，促進(jìn)草類植物代謝和基因調(diào)控機(jī)理研究。探明草類植物的營養(yǎng)代謝、激素調(diào)控、水分運(yùn)輸?shù)扰c生長發(fā)育相關(guān)的代謝調(diào)控途徑及生物和非生物逆境應(yīng)答途徑，對于促進(jìn)草類植物的資源開發(fā)、栽培利用等都具有重要的意義。

3.3 遺傳改良

目前，在草類植物遺傳改良的研究中，已開展應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對百脈根共生固氮SNF相關(guān)基因進(jìn)行編輯研究[88]，對蒺藜苜?；騁US組定向編輯研究[89]，對PDS基因進(jìn)行定點敲除研究[90]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用在牧草和草坪草的遺傳改良，能有針對性的在基因組水平上改造牧草和草坪草的遺傳性狀，提高育種的目的性和可操作性，用過設(shè)計目標(biāo)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生可遺傳變異，更加快速、高效的獲得基因組靶位點的突變、特異性變異和定向基因修飾等，加速草業(yè)領(lǐng)域培育優(yōu)良品種進(jìn)程。根據(jù)草類植物的培育需求，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)使優(yōu)良基因定點整合，針對草坪草改良抗旱、耐病、耐踐踏、再生性強(qiáng)等性狀的基因，針對牧草定向改良抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等基因性狀，針對生態(tài)修復(fù)用途的草類植物可改良耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)、耐鹽堿、抗風(fēng)、抗倒伏等一些特定需求的基因性狀，同時探討多個優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的聚合。使得遺傳改良效率更高，使牧草和草坪草育種更具科學(xué)性和精確性。

應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)必將加快現(xiàn)代牧草和草坪草遺傳改良育種進(jìn)程，成為提高產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)的一個重要契機(jī)，基因組編輯的研究快速發(fā)展，推動基因的功能研究和物種的改良，必將為草業(yè)領(lǐng)域基因功能基礎(chǔ)理論研究和遺傳改良應(yīng)用帶來廣闊的應(yīng)用前景，為草業(yè)的發(fā)展帶來新的契機(jī)。

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(責(zé)任編輯 王芳)

CRISPR/Cas9 system and its prospective application in grass

Wang Dan1,2, Zhou Mei-liang2, Li Jin-bo3, Sun Zhan-min2, Wu Yan-min1, 2
(1.College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China;2.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing 100081, China；3.Shenzhen Techand Landscape Co., Ltd. Shenzhen 518040, China)

The CRISPR/Cas9 system is a new, precise genome editing technology, which has

wide attention from the scientific community globally. CRISPR/Cas9 is widely utilised for studying gene functions, because it enables precise modification of specific gene sites, including knockout, insertion, and substitution. CRISPR/Cas9 has many advantages, including convenience, precision, efficiency, and a wide selection of target sites. Presently, this technology is applied in all the field of life sciences, including microorganisms, plants, animals, and human gene therapy. The present article briefly introduces the course of development of CRISPR/Cas9 technology, mechanism of action, technical advantage, functions, and its applications. It summarizes the progresses in targetted plant genome editing, and discusses the potential applications of this process in research on grass species, including studies on functional genomics, gene metabolism and regulation, and genetic improvement, which provides a useful reference for the later researches and application of this field.

CRISPR/Cas9 system; genome editing; grass; targeted mutagenesis; gene function research; genetic improvement

Wu Yan-min E-mail：wuyanmin@caas.cn

2016-07-20 接受日期：2016-11-01

國家自然科學(xué)基金項目(31372361)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展“973”項目(2014CB138701)；廣東省省級科技計劃項目(2015B090904008)

王丹(1982-)，女，遼寧本溪人，在讀博士生，研究方向為植物逆境生理與分子生物學(xué)。 E-mail：wangdd0310@163.com

吳燕民(1955-)，男，陜西子長人，研究員，博士，研究方向為植物分子生物學(xué)與基因工程。E-mail：wuyanmin@caas.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0396

S540.32;Q943.2

A

1001-0629(2017)06-1204-11

王丹,周美亮,李金博,孫占敏,吳燕民.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在草類植物中的應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2017,34(6)：1204-1214.

Wang D,Zhou M L,Li J B,Sun Z M,Wu Y M.CRISPR/Cas9 system and its prospective application in grass.Pratacultural Science，2017,34(6)：1204-1214.