陳望，劉和錄，劉瓊，徐志康，汪奇云，於艷霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518104)

血漿miR-152-3p作為肺癌診治指標(biāo)的臨床價(jià)值

陳望，劉和錄，劉瓊，徐志康，汪奇云，於艷霞

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518104)

目的探討血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平在肺癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)我院和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所收集的2014年5～10月55例Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者和53例健康人群血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較兩組結(jié)果之間是否存在差異性，同時(shí)運(yùn)用ROC曲線分析評(píng)價(jià)miR-152-3p對(duì)肺癌早期診斷的價(jià)值。結(jié)果肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平為(4.71±2.18)，健康組為(7.34±4.15)，肺癌患者明顯低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.223，P＜0.05)；血漿miR-152-3p濃度ROC曲線下面積(AUC)為0.689；當(dāng)血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平在最佳臨界值5.6時(shí)，血漿miR-152-3p對(duì)肺癌診斷的特異性為67.3%，敏感性為62.3%；不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、I期和II期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平明顯低于健康人群，但對(duì)肺癌早期診斷的準(zhǔn)確性較低，需結(jié)合其他生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)。

肺癌；miR-152-3p；逆轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)；診斷

近50年來肺癌發(fā)病率顯著增高，居目前全世界癌癥死因的首位，而且預(yù)后較差[1-2]。肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟和多因素的過程，早期一般無癥狀，大多數(shù)患者確診肺癌時(shí)已多是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。在未來40～50年肺癌將是構(gòu)成人類健康最大威脅的疾病[3]。因此，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于尋找新的腫瘤生物標(biāo)志物來用于肺癌的早期診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷。

microRNAs(miRNAs)是一類不編碼蛋白質(zhì)，單鏈的小RNA，由19～30個(gè)核苷酸組成。自從1993年被發(fā)現(xiàn)以來，miRNAs在細(xì)胞功能調(diào)控的多方面發(fā)揮著重大的作用[4-5]。近期研究顯示miRNAs的特異性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，其中一些miRNA呈現(xiàn)出促癌或抑癌作用[6]。也有研究結(jié)果顯示血漿中miRNAs有可能成為肺癌早期診斷的新生物標(biāo)志物，為肺癌的早期臨床診斷、治療和預(yù)后判斷提供可靠的科學(xué)依據(jù)[7-9]。本研究以外周靜脈血為檢測(cè)標(biāo)本，通過相應(yīng)循環(huán)血漿RNA提取技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平來探討其在肺癌早期診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年5～10月期間來我院和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所就診的肺癌患者55例，其中男性31例，女性24例；年齡31～81歲，平均(60.71±10.62)歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為肺癌新發(fā)病例，其中小細(xì)胞型肺癌10例，非小細(xì)胞型肺癌45例。標(biāo)本采集前一年內(nèi)沒有放射治療和外科手術(shù)治療，病案跟蹤至少兩年。對(duì)照組53例健康人群均來自干部體檢人群，男性24例，女性29例；年齡44～91歲，平均(57.11±12.09)歲。確保兩組研究對(duì)象的年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 儀器與試劑SLAN-96P型PCR分析儀由上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供；ABI step one plus熒光PCR分析儀由美國ABI公司提供；血漿miRNA提取試劑盒miReasy Mini Kit，miRNA逆轉(zhuǎn)錄的miScript Reverse Transcription Kit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit均由德國Qiagen公司提供；miR-152-3P定量PCR引物序列為TCAGTGCATGACAGAACTTGG。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集所有研究對(duì)象均采用一次性真空采血管采集靜脈血5.0 mL于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，混勻離心分離血漿，吸500 μL血漿于1.0 mL冷凍管內(nèi)置于-80℃低溫保存。

1.3.2 循環(huán)血漿microRNA提取取400 μL低溫冷藏的血漿樣本，加入5倍體積的QIAzol試劑，置于冰上融化，充分混勻。放置室溫5 min，加入等體積100%氯仿，振蕩混勻，室溫放置2～3 min，4℃，12 000 g離心15 min，取上層水相300 μL轉(zhuǎn)移至新的離心管中，取加入1.5倍體積100%乙醇，充分混勻。按miReasy Mini Kit的操作手冊(cè)用吸附柱提取RNA。用30 μL的RNease-free water溶解RNA，置于-80℃低溫冰箱保存。為將RNA提取效率及PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，在每個(gè)提取標(biāo)本中加入25 fmol的合成線蟲miR-54 (Cel-miR-54)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-152-3p取15 μL RNA樣本，4 μL Buffer RT，1 μL Mix，up to 20 μL，使用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒于PCR儀上進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)條件為：37℃1 h，95℃5 min。qPCR反應(yīng)按miScript SYBR Green PCR Kit試試劑盒操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：miScript SYBR Green Mix 10 μL，PCR正向和反向引物各0.4 μL，模板cDNA 1 μL，加滅菌蒸餾H2Oμp to 20 μL。在ABI step one plus熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃15 min；94℃30 s，55℃15 s，70℃30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每份cDNA均在相同條件下進(jìn)行miR-152-3p的檢測(cè)，設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，所有樣本重復(fù)3次，陰性對(duì)照以DEPC H2O代替模板cDNA。

1.3.4 miRNA-152-3p濃度相對(duì)水平計(jì)算濃度相對(duì)水平(Re)采用比較CT法定量，計(jì)算方法為2-△△CT法，計(jì)算公式為△CTc=CTc目-CTc內(nèi)，△CTn=CTn目-CTn內(nèi)(c為肺癌組，n為對(duì)照組)。濃度相對(duì)水平進(jìn)行對(duì)數(shù)(log2Re=-△CT)處理后，計(jì)算miRNA-152-3p基因的起始模板量從而反映出miRNA-152-3p基因的濃度相對(duì)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS18.0軟件制作miRNA-152-3p的受試者ROC曲線圖，以ROC曲線來分析miRNA-152-3p對(duì)早期肺癌的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平為(4.71±2.18)，對(duì)照組為(7.3415±4.15)，肺癌患者明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.223，P＜0.05)。

2.2 血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平的ROC曲線分析對(duì)血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行ROC曲線分析，miR-152-3p濃度相對(duì)水平曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)為0.689(95%置信區(qū)間CI為0.589～0.789)。當(dāng)血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平為最佳臨界值5.6時(shí)，血漿中miR-152-3p對(duì)肺癌早期診斷的特異性為67.3%，敏感性為62.3%，見圖1。

圖1 血漿miR-152-3p濃度相對(duì)水平的ROC曲線

2.3 不同臨床病理特征肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平比較

3 討論

MiRNA是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度18～25個(gè)核糖核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶標(biāo)基因完全或不完全配對(duì)結(jié)合后，抑制靶標(biāo)基因mRNA翻譯或降解靶標(biāo)基因mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白的表達(dá)，參與細(xì)胞生命活動(dòng)，與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)及凋亡等密切相關(guān)[10]。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，miRNA特異性表達(dá)與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性是目前的熱點(diǎn)[11]。近期研究表明，多種miRNA參與了癌細(xì)胞重要生物程序的調(diào)控，發(fā)揮了抑癌基因或促癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起了重要的作用，且miRNA在腫瘤的診斷、治療及療效判斷中作用也越來越受到重視[12]。

腫瘤患者和正常健康人群的組織、血漿和血清中MiRNAs水平表達(dá)存在差異性。Chen等[13]采用Solexa測(cè)序法對(duì)健康人和非小細(xì)胞肺癌患者血清的miRNAs分析結(jié)果顯示，兩組血清中miRNA分子譜存在明顯差異性，健康人群檢出28種miRNA，而肺癌患者未檢出，但檢測(cè)出了63種健康人群沒有的miRNA；Mitchell等[14]研究結(jié)果也顯示，miRNAs在血漿或血清中以非常穩(wěn)定的形式存在，且能夠抵抗RNA酶的降解，這提示血漿或血清中miRNAs可以作為足夠穩(wěn)定的生物學(xué)標(biāo)記物被加以臨床應(yīng)用。

MiRNA還被發(fā)現(xiàn)可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)志物，有助于肺癌的早期診斷、個(gè)性化治療及預(yù)后判斷[15]。其被發(fā)現(xiàn)在某些常見腫瘤如肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌及直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程起到重要的作用，為腫瘤的早期診斷、治療、預(yù)后判斷提供了可靠的依據(jù)和新的研究方向。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平顯著低于健康人群組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這可能表明miR-152-3p有抑癌作用，而不同年齡、性別、吸煙和不吸煙、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌患者血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

通過對(duì)血漿miRNA-152-3p濃度相對(duì)水平進(jìn)行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-152-3p濃度相對(duì)水平ROC曲線下面積為0.689。根據(jù)報(bào)道可知，ROC是一種全面和準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腫瘤標(biāo)志物在臨床診斷應(yīng)用的非常有效的方法，AUC在0.5～0.7時(shí)為有較低的準(zhǔn)確性[16]。當(dāng)miR-152-3p濃度相對(duì)水平取最佳臨界值5.6時(shí)，血漿中miR-152-3p對(duì)肺癌早期診斷的特異性和敏感度分別為67.3%和62.3%。

綜上所述，血漿中miR-152-3p濃度相對(duì)水平對(duì)肺癌早期診斷的價(jià)值較低，其作為肺癌單獨(dú)診斷指標(biāo)存在不足，如果能聯(lián)合少數(shù)其他循環(huán)血漿中miRNA指標(biāo)來提高診斷的特異性和敏感度，對(duì)腫瘤早期診斷具有更廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)為肺癌的早期診斷提供新的、可靠的檢查方案，以達(dá)到肺癌早診斷和早治療的目的，對(duì)患者預(yù)后康復(fù)、提高患者生存率及生活質(zhì)量具有重要意義。

[1]Meng J,Xie W,Cao L,et al.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2010,42(1):52-57.

[2]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[3]Ramalingam SS,Owonikoko TK,Khuri FR.Lung cancer:New biological insights and recent therapeutic advances[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):91-112.

[4]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 [J].Cell,1993,75(5):843-854.

[5]Vrba L,Jensen TJ,Garbe JC,et al.Role for DNA methylation in the regulation of miR-200c and miR-141 expression in normal and cancer cells[J].PLoS One,2010,5(1):e8697.

[6]Guo X,Chen Y,Xu Z,et al.Prognostic significance of VEGF-C expression in correlation with CO2,lymphatic microvessel density, and clinicopathologic characteristics in human non-small cell lung cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2009,41(3): 217-222.

[7]曾龍劍,吳錫南,楊凱云,等.miR-10b、miR-18b及miR-130b在肺癌中的表達(dá)研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(10):28-31.

[8]Liu ZL,Wang H,Liu J,et al.MicroRNA-21(miR-21)expression promotes growth,metastasis,and chemo-or radioresistance in non-small cell lung cancer cells by targeting PTEN[J].Mol Cell Biochem,2013,372(1-2):35-45.

[9]馮麗萍,羅亮,蘇文媚.血漿miR-221在小細(xì)胞肺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國癌癥雜志,2014,(3):217-224.

[10]Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CACancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[11]Nana-Sinkam SP,Croce CM.MicroRNAs as therapeutic targets in cancer[J].Transl Res,2011,157(4):216-225.

[12]Vora N,Reckamp KL.Non-small cell lung cancer in the elderly:defining treatment options[J].Semin Oncol,2008,35(6):590-596.

[13]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases [J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[14]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2008,105(30):10513-10518.

[15]Olson P,Lu J,Zhang H,et al.MicroRNA dynamics in the stages of tumorigenesis correlate with hallmark capabilities of cancer[J]. Genes Dev,2009,23(18):2152-2165.

[16]陳衛(wèi)中,倪宗瓚,潘曉平,等.用ROC曲線確定最佳臨界點(diǎn)和可疑值范圍[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2005,32(7):729-731.

Clinical value of plasma miR-152-3p in early diagnosis of lung cancer.

CHEN Wang,LIU He-lu,LIU Qiong,XU Zhi-kang,WANG Qi-yun,YU Yan-xia.
Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Shajing Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Shenzhen 518104,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the application value of plasma miR-152-3p in the early diagnosis of lung cancer.MethodsmiR-152-3p levels were detected in 55 patients with stageⅠ,Ⅱlung cancer and 53 healthy adults (healthy group)in plasma in our hospital and Institute of Respiratory Diseases,Guangzhou Medical University from May 2014 to October 2014 by real-time fluorescence quantitative-PCR(RT-qPCR).The test results were statistically analyzed.The differences between the two groups were compared.Receiver operating characteristic(ROC)curves were used to evaluate the value of miR-152-3p in the early diagnosis of lung cancer.ResultsThe miR-152-3p relative levels in plasma of lung cancer patients was(4.71±2.18),which was significantly lower than(7.34±4.15)in healthy group (t=4.223,P＜0.05).The area under the ROC curve(AUC)of the plasma miR-152-3p concentration was 0.689.When the concentration of miR-152-3p in plasma was at the optimum critical value of 5.6,and the specificity of plasma miR-152-3p in diagnosis of lung cancer was 67.3%,with the sensitivity of 62.3%.There were no statistically significant differences in plasma miR-152-3p concentrations between patients with different age,sex,smoking and non-smoking, stageⅠand stageⅡlung cancer(P＞0.05).ConclusionRelative concentration of miR-152-3p in plasma of patients with lung cancer is significantly lower than that of healthy people,but its accuracy for early diagnosis of lung cancer is low,which should be detected in combination with other biomarkers.

Lung cancer;miR-152-3p;Reverse transcription quantitative PCR technique(RT-qPCR);Diagnosis

R734.2

A

1003—6350（2017）12—1959—03

2016-11-04)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.12.022

深圳市寶安區(qū)科技項(xiàng)目(編號(hào)：2014202)

陳望。E-mail：195269566@qq.com