文│譚勝國(guó)（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院） 高華 陳志剛 何文輝（湖南省沅江市畜牧水產(chǎn)局） 陳洋清（湖南省新寧縣畜牧水產(chǎn)局） 李海輝（湖南“豬衛(wèi)士”服務(wù)有限公司）

TJM-F92株弱毒疫苗免疫效果評(píng)估

文│譚勝國(guó)（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院） 高華 陳志剛 何文輝（湖南省沅江市畜牧水產(chǎn)局） 陳洋清（湖南省新寧縣畜牧水產(chǎn)局） 李海輝（湖南“豬衛(wèi)士”服務(wù)有限公司）

豬高致病性藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）在編碼Nsp2的基因上發(fā)生缺失的變異毒株引起的一種急性、高致死性傳染病，病毒致病力強(qiáng)，傳播速度快，豬群發(fā)病率和死亡率高。母豬感染后發(fā)生流產(chǎn)、死胎、弱胎等，流產(chǎn)率可達(dá)30%以上；仔豬感染后表現(xiàn)為呼吸困難、敗血癥等癥狀，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)50%以上。該病在臨床上較難控制，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。

近幾年，針對(duì)高致病性藍(lán)耳病的控制方法，國(guó)內(nèi)外專家各持己見，但大致可歸為兩種：一種是通過病毒馴化措施和生物安全體系來(lái)控制，即通過自然或人工感染的辦法（如全群返飼本場(chǎng)急性感染豬的排泄物或直接接種適當(dāng)劑量的病毒粒子等）將豬群一次性暴露于藍(lán)耳病的高感染壓力和風(fēng)險(xiǎn)之下，進(jìn)行場(chǎng)內(nèi)病毒馴化，逐步穩(wěn)定豬群；并通過嚴(yán)格的生物安全管理體系封閉全場(chǎng)，經(jīng)200天左右讓豬群逐步轉(zhuǎn)陰，同時(shí)不斷培育藍(lán)耳病陰性的后備種豬群來(lái)補(bǔ)充生產(chǎn)。另一種則是通過“堅(jiān)持疫苗免疫、藥物保健和必要的生物安全管理措施”三者相結(jié)合來(lái)控制，即通過每年免疫適當(dāng)毒株的藍(lán)耳病弱毒疫苗2～3次，結(jié)合藥物保健和生物安全措施，打造和培育適應(yīng)本場(chǎng)氣候、具備藍(lán)耳病優(yōu)勢(shì)、穩(wěn)定毒株的經(jīng)產(chǎn)種豬群來(lái)持續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)。顯而易見，前者需要先進(jìn)的生產(chǎn)設(shè)施、過硬的生產(chǎn)管理技能以及完善的生物安全體系作支持，而從目前國(guó)內(nèi)很多規(guī)?；i場(chǎng)實(shí)際情況來(lái)看后者更適用。

湖南生物機(jī)電職院動(dòng)物科技系與湖南“豬衛(wèi)士”服務(wù)有限公司共建的豬病防控中心，通過抗原抗體監(jiān)測(cè)篩選出湖南省內(nèi)某高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRS）臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定且活躍的豬場(chǎng)，采用“TJM-F92變異株P(guān)RRSV弱毒疫苗免疫、適當(dāng)藥物保健和必要的生物安全管理”相結(jié)合的措施進(jìn)行綜合干預(yù)；同時(shí)，通過IDEXX血清-ELISA方法跟蹤對(duì)比監(jiān)測(cè)PRRS抗體消長(zhǎng)規(guī)律和對(duì)生產(chǎn)報(bào)表數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行疫苗免疫效果評(píng)估，為豬場(chǎng)綜合防控藍(lán)耳病提供依據(jù)。

一、試驗(yàn)材料與方法

1.試驗(yàn)材料。通過RT-PCR和ELISA等抗原抗體檢測(cè)方法篩選出湖南省內(nèi)某千頭母豬存欄規(guī)模、高致病性藍(lán)耳病臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定且活躍的豬場(chǎng)作為試驗(yàn)豬場(chǎng)。高致病性藍(lán)耳病RT-PCR病原診斷試劑盒由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中央與地方共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，擴(kuò)增片段包括Nsp2基因的整個(gè)缺失區(qū)，目的條帶大小約480堿基對(duì)（bp）。藍(lán)耳病ELISA檢測(cè)試劑盒為IDEXX PRRSX3，由美國(guó)IDEXX生產(chǎn)。試驗(yàn)用疫苗是國(guó)內(nèi)某廠家高致病性藍(lán)耳病TJM-F92變異株弱毒疫苗。

2.試驗(yàn)方法。試驗(yàn)時(shí)間為2015年12月到2016年3月，進(jìn)行為期4個(gè)月的跟蹤監(jiān)測(cè)。

（1）情況調(diào)查。通過現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查方法對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)基本概況、發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、基礎(chǔ)免疫和生產(chǎn)異動(dòng)等基本情況進(jìn)行摸底了解。根據(jù)動(dòng)物疫病抗體檢測(cè)樣本數(shù)量與準(zhǔn)確性的關(guān)系，按90%以上的準(zhǔn)確性對(duì)全場(chǎng)母豬群進(jìn)行隨機(jī)抽樣，共采集血清樣品38份進(jìn)行抗體檢測(cè)，其中流產(chǎn)母豬8份、暫定健康母豬30份，評(píng)估藍(lán)耳病血清學(xué)抗體水平的穩(wěn)定性。通過前腔靜脈無(wú)菌采血的方法，采集臨床發(fā)病呈急性感染的母豬全血5份，運(yùn)用RT-PCR方法進(jìn)行病毒特異性檢測(cè)。

（2）疫苗免疫與抗體水平監(jiān)測(cè)。通過抗原抗體檢測(cè)確定為“高致病性藍(lán)耳病陽(yáng)性活躍場(chǎng)”后，在表現(xiàn)出臨床癥狀的早期立即采用高致病性藍(lán)耳病TJM-F92變異株弱毒疫苗對(duì)全場(chǎng)繁殖母豬群進(jìn)行普免干預(yù)（劑量為1頭份/頭）。分別于免疫前、免疫后30天和90天，按90%以上的準(zhǔn)確性對(duì)全場(chǎng)母豬群進(jìn)行隨機(jī)抽樣，并進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，跟蹤監(jiān)測(cè)免疫前后抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律。

（3）其他綜合性措施。一是封閉全場(chǎng)繁殖種豬群，暫時(shí)不引進(jìn)種豬，確立豬群“單向流動(dòng)”原則（即全場(chǎng)只出不進(jìn)）；同時(shí)對(duì)臨床表現(xiàn)為“頑固性子宮炎癥、屢配不孕、體弱多病及生產(chǎn)性能差”的種豬立即清除出生產(chǎn)群和淘汰。二是嚴(yán)格執(zhí)行豬場(chǎng)的各級(jí)生物安全和消毒制度，尤其是哺乳和保育階段的“全進(jìn)全出”和“空欄清洗、消毒”措施，防止場(chǎng)內(nèi)病毒的交叉和持續(xù)循環(huán)感染。三是選用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（如泰萬(wàn)菌素或替米考星）和板藍(lán)根、大青葉等中草藥，在不影響豬群采食量的基礎(chǔ)上，對(duì)母豬產(chǎn)前、產(chǎn)后和仔豬斷奶前后進(jìn)行各1周的藥物保健。

（4）生產(chǎn)穩(wěn)定情況評(píng)估。根據(jù)試驗(yàn)期間主要臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)（返情與流產(chǎn)胎數(shù)、死胎與木乃伊胎比例、哺乳成活率和保育成活率）綜合分析，對(duì)豬場(chǎng)生產(chǎn)情況進(jìn)行簡(jiǎn)要評(píng)估。

（5）試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)。IDEXX PRRSX3 ELISA試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照的平均OD650－陰性對(duì)照的平均OD650＞0.15，陰性對(duì)照的平均OD650＜0.15。S/P值計(jì)算方法：S/P=（樣品OD650-陰性對(duì)照的平均OD650）/（陽(yáng)性對(duì)照的平均OD650-陰性對(duì)照的平均OD650）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性值為S/P﹤0.4；陽(yáng)性值為S/ P≥0.4。

表1 38份母豬樣品IDEXX血清-ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

二、結(jié)果與分析

1.藍(lán)耳病不穩(wěn)定活躍豬場(chǎng)背景調(diào)查。

（1）臨床情況調(diào)查。湖南省岳陽(yáng)市某千頭存欄母豬的規(guī)模化豬場(chǎng)于2015年11月29日至12月12日突然發(fā)生妊娠母豬集中流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象，母豬高熱、不食、局部皮膚發(fā)紺，繼而流產(chǎn)和產(chǎn)死胎，近半個(gè)月之內(nèi)，流產(chǎn)和產(chǎn)死胎的母豬達(dá)到30余頭。經(jīng)調(diào)查，該場(chǎng)的免疫及防疫制度較為混亂：一方面，曾使用過勃林格（V2332經(jīng)典株）和中牧股份（Jiangxi-1R變異株）兩種不同毒株的藍(lán)耳病弱毒疫苗，但免疫執(zhí)行不到位，隨意性較強(qiáng)（發(fā)病時(shí)種豬群已超過6個(gè)月未進(jìn)行疫苗免疫）；另一方面，頻繁引種，且不經(jīng)任何隔離及馴化措施便并群生產(chǎn)（據(jù)調(diào)查了解，該場(chǎng)最近1次引種并群的時(shí)間為2015年11月20日）。

（2）血清學(xué)ELISA調(diào)查。38份母豬血清樣品經(jīng)IDEXX PRRSX3 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果見表1，PRRS血清學(xué)抗體水平的穩(wěn)定性結(jié)果如下：暫定健康母豬群的藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性率為57%，平均S/P值0.77，離散度81%，整體水平偏低，血清學(xué)抗體分布欠整齊，雖仍處于相對(duì)穩(wěn)定，但受感染的風(fēng)險(xiǎn)較高（藍(lán)耳病抗體陰性率達(dá)43%）；而流產(chǎn)母豬群的藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性率為88%，強(qiáng)陽(yáng)性率（即S/P＞2.5的比例）為37.5%，平均S/P值1.88，離散度82%，血清學(xué)抗體分布呈兩極化，急性病毒血癥極為明顯（2頭流產(chǎn)母豬藍(lán)耳病抗體S/P值＞3.6）。由此可見，流產(chǎn)母豬群極有可能受到了藍(lán)耳病野毒的攻擊，臨床已出現(xiàn)妊娠母豬急性感染。

（3）病原學(xué)調(diào)查。5份發(fā)病母豬的全血樣品經(jīng)高致病性藍(lán)耳病RTPCR病原特異性檢測(cè)，得到目的條帶為480bp，與引物設(shè)計(jì)結(jié)果一致，表明血清有高致病性藍(lán)耳病病原，且HP-PRRSV呈陽(yáng)性的樣品檢出率為60%（3/5）。由此進(jìn)一步證實(shí)，妊娠母豬受到了高致病性藍(lán)耳病野毒的攻擊而導(dǎo)致集中流產(chǎn)和產(chǎn)死胎。

2.抗體水平監(jiān)測(cè)。免疫前、免疫后30天和90天隨機(jī)采集的母豬血清樣品經(jīng)IDEXX PRRSX3 ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，免疫前藍(lán)耳病血清學(xué)抗體處于較低水平（陽(yáng)性率為63%，強(qiáng)陽(yáng)性率8%，平均S/P值1.00，離散度98%，抗體分布呈兩極化）；免疫后30天達(dá)到抗體高峰值（陽(yáng)性率91%，強(qiáng)陽(yáng)性率65%，平均S/P值3.04，離散度49%，病毒血癥活躍）；免疫后90天恢復(fù)至免疫前水平（陽(yáng)性率63%，強(qiáng)陽(yáng)性率13%，平均S/P值0.99，離散度95%，抗體分布仍表現(xiàn)出兩極化）。

3.臨床生產(chǎn)情況評(píng)估。試驗(yàn)期間主要臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)（返情與流產(chǎn)胎數(shù)、死胎與木乃伊胎比例、哺乳成活率和保育成活率）綜合分析見表3。由表3可知，試驗(yàn)期間雖通過采取疫苗干預(yù)和生物安全管理等綜合性措施，豬場(chǎng)的臨床生產(chǎn)成績(jī)有所改善，尤其是對(duì)繁殖種豬群進(jìn)行封群和清群管理（即杜絕場(chǎng)外傳染源和清除場(chǎng)內(nèi)傳染源）以后，母豬的集中流產(chǎn)和高比例返情現(xiàn)象得到顯著改善；但死胎與木乃伊胎比例居高不下，哺乳仔豬死亡率持續(xù)升高（可能還與春節(jié)期間人員流動(dòng)及氣溫等因素有關(guān)）等現(xiàn)象在一定程度上仍反映出“藍(lán)耳病毒的持續(xù)性感染問題”。

三、小結(jié)與討論

1.通過臨床發(fā)病情況及血清學(xué)ELISA調(diào)查和RT-PCR病原學(xué)檢測(cè)證實(shí)，該場(chǎng)為高致病性藍(lán)耳病不穩(wěn)定活躍豬場(chǎng)。該場(chǎng)在臨床上表現(xiàn)出的妊娠母豬集中流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象是由高致病性藍(lán)耳病野毒攻擊而引起，其具體原因應(yīng)與種豬群長(zhǎng)時(shí)間未執(zhí)行藍(lán)耳病免疫，生產(chǎn)母豬群藍(lán)耳病血清學(xué)抗體轉(zhuǎn)陰率較高（抽檢的陰性率在40%左右），受感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，再加上頻繁引進(jìn)未經(jīng)隔離與馴化的帶毒豬群并入生產(chǎn)群等因素有關(guān)。

2.據(jù)資料顯示，IDEXX PRRSX3 ELISA是以核衣殼蛋白（N 蛋白）作為主要包被抗原的PRRSV抗體間接ELISA方法。因核衣殼蛋白（N 蛋白）主要參與PRRSV組裝與復(fù)制，故而IDEXX PRRSX3 ELISA檢測(cè)的N蛋白抗體水平在一定程度上反映了PRRSV病毒復(fù)制與感染狀態(tài)，所以該方法通常被用于評(píng)估豬群的PRRS感染狀態(tài)或感染風(fēng)險(xiǎn)。

表2 IDEXX血清-ELISA方法監(jiān)測(cè)免疫前后抗體水平消長(zhǎng)情況

表3 試驗(yàn)期間主要臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)分綜合析

3.本試驗(yàn)在TJM-F92變異株弱毒疫苗普免30天后檢測(cè)到的PRRSV抗體水平峰值（陽(yáng)性率91%，強(qiáng)陽(yáng)性率65%，平均S/P值3.04）反映出PRRSV（疫苗毒或野毒）的高感染水平，病毒血癥活躍。這一現(xiàn)象與疫苗廠家所倡導(dǎo)的疫苗免疫效果（TJM-F92株疫苗毒缺失了PRRSV毒力基因，免疫后疫苗毒血癥較輕，帶毒與排毒時(shí)間短）不同；另與豬病防控中心多年來(lái)監(jiān)測(cè)到不同毒株疫苗免疫后的PRRSV抗體水平也相差甚遠(yuǎn)（勃林格V2332株P(guān)RRS疫苗免疫30天后平均抗體S/P值一般在1.0～2.0，病毒血癥比例在10%左右；JiangXi-1R株P(guān)RRS弱毒疫苗免疫30天后平均抗體S/P值一般在2.0左右，病毒血癥比例在20%以內(nèi)）。由此推測(cè)，上述PRRSV抗體水平峰值并非疫苗毒所產(chǎn)生，而是野毒攻擊所致，且極有可能是通過疫苗注射時(shí)的針頭將一定數(shù)量的PRRSV野毒粒子擴(kuò)散與感染所致（臨床上注射疫苗時(shí)未能有效做到“一豬一針頭”）。臨床生產(chǎn)上表現(xiàn)的“死胎與木乃伊胎比例持續(xù)居高不下，哺乳仔豬死亡率持續(xù)升高”也能驗(yàn)證這一點(diǎn)。

4.本次試驗(yàn)篩選出湖南省內(nèi)某高致病性藍(lán)耳病臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定且活躍的豬場(chǎng)，進(jìn)行了階段性的疫苗免疫探索與評(píng)估，從PRRSV抗體血清-ELISA 跟蹤監(jiān)測(cè)和臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析得知，TJM-F92變異株P(guān)RRSV弱毒疫苗作臨床緊急免疫時(shí)不能有效阻止PRRSV野毒持續(xù)感染與排毒。