余鈴 高天 張政佩 陶春杰 郭衛(wèi)春 方志偉 樊征夫

·基礎(chǔ)研究·

阿霉素通過激活Notch信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞干性特性*

余鈴①高天②張政佩①陶春杰①郭衛(wèi)春①方志偉②樊征夫②

目的：骨肉瘤干細(xì)胞具有化療耐藥性。本文擬探討耐阿霉素細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的改變，以及Notch通路在其中的調(diào)控作用。方法：采用2 μM的阿霉素處理骨肉瘤細(xì)胞143B 24 h，去藥繼續(xù)培養(yǎng)5 d，檢測干細(xì)胞樣特性的改變，包括形態(tài)學(xué)的改變、Stro-1+/CD117+雙陽性細(xì)胞比例、干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)、懸浮成球的能力、EMT特性。qPCR及Western blot檢測Notch通路受體及靶基因表達(dá)情況。利用Notch抑制劑DAPT預(yù)處理，檢測其對耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性的影響。構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，檢測Notch抑制劑對體內(nèi)成瘤的影響。結(jié)果：耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞中Stro-1+/CD117+比例增高，干細(xì)胞相關(guān)基因Oct4、Sox2表達(dá)量增加，懸浮成球能力增強(qiáng)，EMT特性上調(diào)。qPCR及Western blot結(jié)果顯示阿霉素耐藥的骨肉瘤細(xì)胞中Notch受體胞內(nèi)段NICD1及靶基因Hes1、Hey1等表達(dá)量上調(diào)。Notch信號抑制劑能夠增強(qiáng)骨肉瘤對阿霉素的化療敏感性，抑制體外阿霉素對骨肉瘤干細(xì)胞的富集作用。動物實驗表明，Notch抑制劑DAPT能夠抑制體內(nèi)成瘤。結(jié)論：阿霉素能夠富集骨肉瘤干細(xì)胞，Notch信號通路參與其中調(diào)控機(jī)制，抑制Notch通路能夠靶向殺傷骨肉瘤細(xì)胞，增加化療藥物敏感性。

阿霉素 骨肉瘤 Notch信號通路 腫瘤干細(xì)胞

骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年。輔助和新輔助化療很大程度上改善了骨肉瘤患者的長期生存率，但化療耐藥和復(fù)發(fā)仍然多見［1-2］。阿霉素是一種有效的一線抗腫瘤藥物，對實體腫瘤有著廣泛的活性譜［3］。阿霉素主要是通過誘導(dǎo)DNA鏈內(nèi)相鄰嘌呤的交聯(lián)發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。有些患者出現(xiàn)原發(fā)或獲得性阿霉素耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

腫瘤干細(xì)胞是指能夠自我更新和具有多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中扮演重要角色［4］。Sicilari等［5］最先發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中存在一小群細(xì)胞能夠在低黏附無血清環(huán)境下形成懸浮球，且具有自我更新能力以及高表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記OCT4和Nanog。Notch信號通路在進(jìn)化上高度保守，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生存、凋亡以及分化［6］。Notch信號通路的功能障礙將阻礙細(xì)胞分化并導(dǎo)致惡變［7-8］，許多報道發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中存在Notch信號異常［9］。但Notch信號在骨肉瘤干細(xì)胞及化療反應(yīng)中的作用尚未完全闡明。本文擬探討耐阿霉素細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的改變，以及Notch通路在其中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞系143B來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）（武漢）。1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）及1%抗生素（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的MEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃、CO2含量為5%、濕度100%的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞活力用臺盼藍(lán)染色檢測，培養(yǎng)基每3天更換一次。

1.2.2 細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試驗 每孔細(xì)胞含100 μL培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8試劑，在37℃下孵育2 h。在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定每孔光密度（OD）。

1.2.3 腫瘤懸浮成球?qū)嶒?將5 000個/mL細(xì)胞接種于添加B27、20 ng/mL人表皮生長因子及20 ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的RPMI 1640培養(yǎng)基的低黏附培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2周以后，直徑>50 μm的克隆集落為懸浮球，并用倒置相差顯微鏡量化計數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞分析 細(xì)胞消化并重懸于70%乙醇中，然后在4℃下固定30 min。PBS洗滌后，4℃下在熒光標(biāo)記的抗體（STRO-1和CD117）或同種型對照IgG中孵育30 min。再次洗滌后用BD流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測，熒光強(qiáng)度用 Cell Quest Soft?ware（BD Biosciences）檢測。

1.2.5 熒光素酶實驗 細(xì)胞用Notch pGreenFire-CBF1報告基因（Systembio）和CMV-Renilla熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒與脂質(zhì)體2 000以3：1比例在OptiMEM中孵育15 min，然后將混合物加入培養(yǎng)基48 h。將細(xì)胞裂解后根據(jù)試劑盒說明用Dual-Glo Lu?ciferase檢測系統(tǒng)檢測冷光，以海參熒光素酶為內(nèi)參。

1.2.6 動物移植瘤 從武漢大學(xué)動物實驗中心購入4周大小的BALB/C裸鼠12只。將裸鼠隨機(jī)分為2組：對照組與DAPT處理組。DAPT溶于二甲基亞砜（DMSO）中，每天腹腔注射（10 mg/kg/d），持續(xù)2周。對照組腹腔注射同等體積DMSO。觀察6周，每周記錄腫瘤生長情況。

1.2.7 實時熒光定量PCR 總RNA用RNeasy Plus Mini Kit試劑盒提取，濃度和純度由ND-1000分光光度計測定。反轉(zhuǎn)錄參照TaqMan熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑說明進(jìn)行。實時定量PCR反應(yīng)采用SYBR Green PCR Master Mix，在7900PCR儀中進(jìn)行。基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計算，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.8 蛋白印記分析 蛋白用蛋白質(zhì)裂解液萃取。裂解后混合液在4℃下10 000 g離心10 min，取上清液。用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。含40 μg蛋白的細(xì)胞裂解液在SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳分離并用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜在含0.05%Tween和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽溶液中室溫封閉1 h。4℃下一抗孵育過夜。一抗使用抗-Hes1（1:500）、抗-Hey1（1:500）和抗-β-actin（1：2000）。辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1:3 000）室溫下孵育2 h。最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物使膜顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以x±s表示。t檢驗用于比較兩組之間的均值，三組以上均值的比較及組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞的富集

研究表明骨肉瘤干細(xì)胞具有耐藥性，推測化療可以富集骨肉瘤干細(xì)胞。為了篩選足以誘導(dǎo)DNA損傷的阿霉素亞致死劑量，實驗首先測試了阿霉素對骨肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。將骨肉瘤細(xì)胞系143B用不同濃度的阿霉素處理24 h，CCK8分析實驗分析細(xì)胞毒性作用，測定的 IC50為 2.46 μM（95%CI：0.87～5.52，圖1A）。為了誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)又不至于引起顯著的細(xì)胞死亡，后續(xù)試驗均用2 μM阿霉素處理24 h。隨后細(xì)胞的生長情況被連續(xù)記錄9 d。如圖1B所示，在這段時間里，細(xì)胞經(jīng)歷了一段短暫的抑制時期，第6 d后生長隨即恢復(fù)正常。搜集第5 d時仍存活的143B細(xì)胞，測定所得的半數(shù)抑制濃度為8.48 μM（95%CI：5.47～16.52），較其親代細(xì)胞顯著增高（P<0.05，圖1C）。上述結(jié)果證實小劑量的阿霉素可以富集耐藥細(xì)胞。

2.2 耐阿霉素的骨肉瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性

為證實亞致死計量的阿霉素是否能夠富集骨肉瘤干細(xì)胞，檢測了去藥后第5 d的骨肉瘤細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性。如圖2A所示，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞中Stro-1/CD117雙陽性細(xì)胞較對照組顯著增多。qPCR及Western blot結(jié)果證實耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因Oct4及Sox2表達(dá)上調(diào)（圖2B，2C）。懸浮成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞的成球率顯著增高（圖2D）。這些結(jié)果表明耐阿霉素細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的干細(xì)胞樣特性。

上皮間質(zhì)樣變（epithelial mesenchymal transition，EMT）與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，實驗也檢測了阿霉素處理是否能誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT。免疫熒光顯示N-鈣黏蛋白在耐阿霉素細(xì)胞中表達(dá)量增高（圖2E），且qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐阿霉素細(xì)胞中EMT特異性啟動子Snail和Slug也出現(xiàn)過表達(dá)（圖2F）。

2.3 Notch信號調(diào)控耐阿霉素細(xì)胞

研究證實Notch信號通路調(diào)控成骨細(xì)胞譜系的增殖和分化，為探究Notch信號通路是否參與調(diào)控阿霉素富集的骨肉瘤干細(xì)胞，本研究首先采用CBF1報告系統(tǒng)檢測了Notch轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果證實耐阿霉素骨肉瘤干細(xì)胞較對照細(xì)胞具有更強(qiáng)的熒光素酶活性（圖3A）。通過qPCR測定了Notch通路靶基因的表達(dá)，包括Hes1、Hes5和Hey1均出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)（圖3B）。與mRNA的表達(dá)一致，Western blot結(jié)果也證實Notch1的胞內(nèi)段NICD1和靶基因Hes1的蛋白水平也顯著上調(diào)（圖3C）。提示Notch1的激活可能在阿霉素誘導(dǎo)的骨肉瘤干細(xì)胞富集中扮演重要的角色。

2.4 抑制Notch信號可增加藥物敏感性并能抑制腫瘤生長

為了研究靶向抑制Notch信號通路能否逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥并減少骨肉瘤干細(xì)胞，實驗利用γ-分泌酶抑制劑（GSIs）處理細(xì)胞。RO4929097（20 μM）預(yù)處理增加了骨肉瘤細(xì)胞的化療敏感性（圖4A）。對于耐阿霉素的骨肉瘤干細(xì)胞，RO4929097能夠顯著抑制其懸浮腫瘤球的形成率（圖4B）。進(jìn)一步構(gòu)建移植瘤動物模型，評估了RO4929097的體內(nèi)抗腫瘤效果，結(jié)果證實RO4929097處理組腫瘤生長時間延遲，且腫瘤體積顯著小于對照組（圖4C）。

圖1 耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞的富集Figure 1 Selection of doxorubicin-resistant osteosarcoma cells

圖2 耐阿霉素的骨肉瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性Figure 2 Chemoresistant osteosarcoma cells possessing traits of cancer stem cells

圖3 Notch信號調(diào)控耐阿霉素CSCsFigure 3 Notch signaling participates in doxorubicin-resistant CSCs

圖4 抑制Notch信號可增加藥物敏感性并能抑制腫瘤生長Figure 4 Inhibition of Notch increases drug resistance and suppresses tumor growth

3 討論

阿霉素暴露可以同時誘發(fā)促生存和促凋亡信號，最終的結(jié)果取決于DNA受損程度以及細(xì)胞所處環(huán)境［10-11］。阿霉素耐藥是影響骨肉瘤療效的重要因素之一。迄今為止，阿霉素耐藥的具體機(jī)制尚不明確。本研究篩選出骨肉瘤中耐阿霉素的一個細(xì)胞亞群。通過對細(xì)胞存活情況的分析，結(jié)果表明經(jīng)過低劑量短時間阿霉素處理的細(xì)胞會經(jīng)歷一段短暫的生長抑制時期，隨即進(jìn)入恢復(fù)期。

研究表明，腫瘤干細(xì)胞較分化的腫瘤細(xì)胞對標(biāo)準(zhǔn)癌癥化療方案更耐藥［12］。本文結(jié)果證實耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞具備干細(xì)胞樣特性。表現(xiàn)為以下幾點：1）耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記Stro-1/CD117；2）耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞中干細(xì)胞性相關(guān)基因Oct4、Sox2表達(dá)量顯著增高；3）耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞的懸浮克隆成球能力顯著增高。

最近有研究報道EMT和干細(xì)胞樣特性的關(guān)系［13-14］。例如，在乳腺癌中，EMT狀態(tài)與腫瘤干細(xì)胞特性具有諸多相似性，包括干細(xì)胞表面分子標(biāo)記CD44+/CD24-的表達(dá)，自我更新能力和對傳統(tǒng)治療方法的抵抗［15］。前期研究發(fā)現(xiàn)間質(zhì)來源的骨肉瘤不表達(dá)上皮性標(biāo)記，然而，骨肉瘤干細(xì)胞表達(dá)更多間質(zhì)性標(biāo)記并表現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動性［16］。與之一致，本研究也發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞表達(dá)EMT標(biāo)記N-鈣黏素且EMT特異性啟動子表達(dá)量增高。

本研究還表明Notch信號參與阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞富集。Notch是一個保守的信號通路，在正常干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞中維持組織動態(tài)平衡［17］。近期有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中Notch通路功能異常［18］。本研究發(fā)現(xiàn)Notch受體的細(xì)胞內(nèi)段NICD1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)量增多。γ分泌酶抑制劑能夠靶向抑制Notch通路，在本研究中，當(dāng)Notch通路被阻斷后，懸浮成球數(shù)量顯著減少，且對阿霉素的敏感性增高。動物實驗也證實，抑制Notch通路可抑制骨肉瘤體內(nèi)生長。這些結(jié)果提示Notch的激活參與調(diào)節(jié)骨肉瘤干細(xì)胞和阿霉素耐藥。

阿霉素暴露與Notch信號之間的關(guān)系尚不明確。有研究表明Notch通過抑制ATM激酶負(fù)性調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)［19］，提示阿霉素可篩選出耐阿霉素的Notch陽性細(xì)胞。也有研究發(fā)現(xiàn)p53能夠直接調(diào)節(jié)Notch信號通路，然后通過影響FOXO3活性介導(dǎo)p53依賴的抗DNA損傷功能［20］，這些結(jié)果支持p53可能是阿霉素和Notch信號通路活化之間的一個中介分子。

綜上所述，本研究表明阿霉素耐藥的骨肉瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性，且Notch信號通路與之密切相關(guān)，抑制Notch通路能夠靶向殺傷骨肉瘤干細(xì)胞和克服阿霉素耐藥。

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（2017-03-15收稿）

（2017-05-08修回）

（編輯：鄭莉 校對：武斌）

Doxorubicin induces enrichment of stem-like cells in osteosarcoma by activating Notch signaling

Ling YU1,Tian GAO2,Zhengpei ZHANG1,Chunjie TAO1,Weichun GUO1,Zhiwei FANG2,Zhengfu FAN2

Zhengfu FAN;E-mail:zhengfufan@126.com
1Department of Orthopedics,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2Department of Orthopedic Oncology,Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research,Ministry of Education,Peking University Cancer Hospital and Institute,Beijing 100142,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81502575)and the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2042015kf0069)

Objective:Cancer stem cells(CSCs)are resistant to chemotherapy.Our study aimed to investigate the stem cell-like properties of doxorubicin-resistant osteosarcoma cell line 143B and its correlation with Notch signaling.Methods:We generated doxorubicinresistant osteosarcoma cells by treating them with 2 μm doxorubicin.Stem cell-like properties such as morphology change,Stro-1/CD117 double positive ratio,stem cell-related gene expression,sphere formation efficiency,and EMT character were assessed on day 5 after doxorubicin withdrawal.Notch receptor and its target genes were examined using qPCR and Western blot analysis.The stem cell-like properties of doxorubicin-resistant osteosarcoma cells were assessed when pretreated with Notch inhibitor or vehicle.The anti-tumor effect of Notch inhibitor was tested using a xenograft model.Results:Doxorubicin-resistant osteosarcoma cells were enriched in Stro-1+/CD117+cells,which showed obvious increased expression of stem cell-related genes,and exhibited enhanced spheroid formation and evident mesenchymal characteristics unlike doxorubicin-sensitive cells.qPCR and Western blot assays showed that Notch intracellular domain 1(NICD1)and target genes Hes1 and Hey1 were upregulated in doxorubicin-resistant osteosarcoma stem cells compared with those in vehicle cells.Furthermore,pretreatment with a γ-secretase inhibitor(GSI)to prevent Notch signaling enhanced chemo-sensitivity and inhibited doxorubicin-enriched osteosarcoma stem cell activity in vitro.Finally,the Notch inhibitor prevented tumor growth in mice xenograft models.Conclusion:Doxorubicin induced the enrichment of osteosarcoma stem-like cells through Notch signaling,and inactivation of Notch could be useful for overcoming drug resistance and eliminating osteosarcoma.

doxorubicin,osteosarcoma,Notch pathway,cancer stem cell

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.11.268

余鈴 專業(yè)方向為骨與軟組織腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail：scaling@whu.edu.cn

①武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨1科（武漢市430060）；②北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所骨與軟組織腫瘤科，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室

*本文課題受國家自然科學(xué)基金（編號：81502575）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（編號：2042015kf0069）資助

樊征夫 zhengfufan@126.com