宋甜甜 肖雨 白春梅 李乃適 陳潔 趙大春 宋玉立 金凱舟 朱麗明 于潤 虞先濬陳原稼

·臨床研究與應用·

微管相關蛋白2在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中的表達及預后意義*

宋甜甜①肖雨②白春梅③李乃適④陳潔⑤趙大春②宋玉立①金凱舟⑥朱麗明①于潤⑦虞先濬⑥陳原稼①

目的：探索微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）與微管相關蛋白1B（microtubule-associated protein 1B，MAP1B）在預測胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumors，PNETs）患者預后中的意義。方法：收集1999年12月至2016年12月來自于北京協(xié)和醫(yī)院、中山大學附屬第一醫(yī)院、復旦大學上海癌癥中心和Cedars-Sinai醫(yī)學中心（洛杉磯）193例患者的193個原發(fā)腫瘤標本。免疫組織化學染色法分別檢測193例、120例PNETs組織中MAP2、MAP1B的表達，隨后分析蛋白表達與患者臨床病理特征及預后的關系。結果：MAP2和MAP1B在PNETs患者中的陽性率分別為45.6%（88/193）和64.2%（77/120）。MAP2表達陽性的患者的總生存好于陰性患者（P=0.012）。另外，MAP2陽性Ⅱ、Ⅲ期患者的總生存也優(yōu)于陰性者（P=0.017）。然而，MAP1B的表達與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學分級、臨床分期、總生存、無病生存均無相關性（P>0.05）。結論：MAP2為潛在的預測PNETs患者預后的指標。

微管相關蛋白2 胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 預后

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumors，PNETs）是一組少見的腫瘤，其發(fā)病率在近三十年內(nèi)顯著上升［1-2］。雖然腫瘤的分級與分期可以預測PNETs患者的預后［2-4］，尋找預后的分子標志物對一部分患者仍然十分必要［5］。

前期研究發(fā)現(xiàn)骨架蛋白α-internexin的表達與PNETs患者的總生存相關［6］。同時，有研究發(fā)現(xiàn)另一個骨架蛋白CK19的表達也與PNETs患者的預后相關［7-8］。最近本課題組蛋白組學的研究發(fā)現(xiàn)兩個骨架蛋白微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）與微管相關蛋白1B（microtubule-associated protein 1B，MAP1B）在PNETs腫瘤組織中表達明顯高于瘤旁組織。黑色素瘤不僅表達神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的標志物［9］，同時與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤如PNETs有組織細胞共性［10］，且研究發(fā)現(xiàn)MAP2在黑色素瘤中的表達與患者的預后相關［11］。MAP1B在腫瘤組織中表達的意義少有報道，雖然越來越多的研究提示微管相關蛋白參與調(diào)控腫瘤細胞的一系列生物學過程［12］，MAP2與MAP1B在PNETs中的表達及意義卻鮮有報道。因此，本研究旨在探索MAP2、MAP1B的表達能否預測PNETs患者的預后。

本課題組近期的多中心研究共納入900余例PNETs患者，隨訪結果發(fā)現(xiàn)所有PNETsⅠ期患者均無病生存，而90%以上的Ⅳ期患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或死亡［13］。歐洲一項研究結果與之類似，該研究共納入1 072例PNETs患者，其中僅1例Ⅰ期（1/248）患者死于腫瘤，半數(shù)以上的Ⅳ期患者死于腫瘤［4］。以上研究提示預測Ⅱ、Ⅲ期患者的生存更有意義。因此本研究同時評估MAP2與MAP1B表達在Ⅱ、Ⅲ期PNETs患者中的預后價值。

1 材料與方法

1.1 病例收集及臨床病理特征

本研究共納入1999年12月至2016年12月來自于北京協(xié)和醫(yī)院、中山大學附屬第一醫(yī)院、復旦大學腫瘤醫(yī)院和Cedars-Sinai醫(yī)學中心（洛杉磯）的193例患者共193個原發(fā)腫瘤。截止到2016年共對87.6%（169/193）的患者進行了隨訪。PNETs的診斷標準如之前所述［6］。腫瘤的分級與分期按照ENETS指南［14］?；颊叩呐R床病理特征在表1中進行了總結。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 石蠟包埋的193個腫瘤組織及121個配對的瘤旁組織脫蠟處理后，微波修復20 min，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶（室溫10min），滴加一抗抗MAP2（濃度1:100），4℃過夜，清洗后滴加兔抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），室溫孵育，DAB顯色，鏡下觀察，隨后蘇木素復染。與之類似，共120個PNETs腫瘤組織與74個配對的瘤旁組織進行脫蠟處理，微波修復20 min，抗MAP1B（Santa Cruz，sc-58784，CA）濃度為1:400。盲法評估染色結果。當細胞胞漿著色為均勻棕黃色時認為陽性，<25%腫瘤細胞著色認為是染色陰性。

1.2.2 MAP2與MAP1B表達與臨床病理特征的關系 首先，分析120個PNETs腫瘤組織中MAP1B表達與患者臨床病理特征的關系并未發(fā)現(xiàn)相關性。然后，探討193例PNETs患者中MAP2表達的意義，同時分析MAP2表達在82例Ⅱ、Ⅲ期PNETs患者中的預后意義。排除2例不明原因死亡患者，對167例隨訪患者采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗進行生存分析，采用Cox回歸模型進行多因素生存分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計方法采用Fisher精確檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗、Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗、Cox回歸模型，采用雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征

在193個腫瘤中，有100例胰島素瘤，9例胃泌素瘤，6例胰高糖素瘤，1例VIP瘤及77例神經(jīng)纖維瘤。193例患者的臨床病理特征總結于表1中。中位隨訪時間為56（1～214）個月。

2.2 PNETs中MAP2與MAP1B的表達

MAP2在腫瘤組織的陽性率為45.6%（88/193）而瘤旁組織的陽性率為1.7%（2/121）（P=5.3×10-17，圖1A）。MAP1B在PNETs中的陽性率為64.2%（77/120），而在瘤旁組織中的陽性率為1.4%（1/74）（P=4.4×10-18）。

2.3 MAP2與MAP1B表達與臨床病理特征及預后的關系

MAP2的表達與確診時年齡、腫瘤大小、分級、分期、總生存相關，而與性別、腫瘤部位及無病生存無相關性（表2）。

Kaplan-Meier生存分析顯示MAP2陽性的PNETs患者具有較好的總生存（P=0.012，圖2A，HR=3.26，95%CI：1.13～9.41，P=0.029，表4），但MAP2陽性患者的無病生存與陰性患者無差別（P=0.410，圖2B）。Kaplan-Meier及多因素生存分析結果提示MAP2表達可能是獨立的預測PNETs患者總生存的分子標志物。

MAP1B表達與臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、分期及生存等均無相關性（表3）。Ka?plan-Meier生存分析也顯示MAP1B表達與總生存及無病生存均無相關性。

如前所述，PNETsⅣ期患者較Ⅰ期患者死亡率高，因此預測PNETsⅡ、Ⅲ期患者的預后更有意義。該研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MAP2陽性的PNETsⅡ、Ⅲ期患者較MAP2陰性的患者總生存好（P=0.017，圖3A，HR=8.74，95%CI：1.11～69.05，P=0.040），而MAP2表達與Ⅱ、Ⅲ期患者的無病生存無相關性（P=0.302，圖3B）。

表1 PNETs患者臨床病理特征 n（%）Table 1 Summary of clinicopathological characteristics of PNETs patientsn(%)

圖1 MAP2和MAP1B在PNETs及對應癌組織中的表達Figure 1 MAP2 and MAP1B expression in PNETs and paired pancreatic tissues

表2 MAP2表達與PNETs患者臨床病理特征的關系Table 2 Correlation of clinicopathological characteristics with MAP2 expression

表3 MAP1B與PNETs患者臨床病理特征的關系Table 3 Correlation of clinicopathological characteristics with MAP1B expression

表3 MAP1B與PNETs患者臨床病理特征的關系（續(xù)表3）Table 3 Correlation of clinicopathological characteristics with MAP1B expression

圖2 PNETs患者Kaplan-Meier生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier plots of patients with PNETs

表4 PNETs患者總生存的Cox回歸模型Table 4 Multivariable Cox model of overall survival

圖3 不同MAP2表達在PNETsⅡ、Ⅲ患者中的預后分析Figure 3 Prognostic value of MAP2 expression in patients with stageⅡandⅢtumors

3 討論

PNETs通常生長緩慢且惡性程度明顯低于胰腺腺癌，但部分PNETs患者預后也較差，如果可以預測患者的預后，那么臨床醫(yī)生可以采取積極的治療措施并緊密隨訪患者。雖然腫瘤的分級、分期、轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及鉻粒素A水平可有效預測PNETs患者預后［2］，但是對部分患者而言分子標志物仍然是必須的預后指標。

最近研究發(fā)現(xiàn)一些分子標志物可預測PNETs患者的預后。如PHD表達增多與PNETs的侵襲性及不良預后相關［15］，此外 KIT［8］及 CK19［7-8］的表達也與PNETs預后相關?；谇捌诘鞍踪|(zhì)組學的研究，本研究發(fā)現(xiàn)MAP2及MAP1B在PNETs腫瘤組織中表達明顯高于瘤旁組織。值得注意的是，之前的研究發(fā)現(xiàn)另外2個骨架蛋白（CK19和α-internexin）也與PNETs患者預后相關［6-8］。本研究分析MAP2與MAP1B表達與PNETs患者的臨床病理特征之間的關系，發(fā)現(xiàn)MAP2的表達與PNETs患者的年齡較小、腫瘤體積較小、臨床分期低及總生存相關。腫瘤的大小是臨床分期的主要依據(jù)之一，同時有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤大小與患者的預后存在相關性［4］，本研究發(fā)現(xiàn)MAP2表達陽性的患者腫瘤較小，而之前體外動物實驗發(fā)現(xiàn)MAP2表達增加可抑制裸鼠黑色素瘤的生長［16］。研究發(fā)現(xiàn)原位黑色素瘤中MAP2表達顯著高于良性色素瘤，同時轉(zhuǎn)移的黑色素瘤腫瘤組織中MAP2的表達顯著低于原位黑色素瘤［11］，細胞實驗發(fā)現(xiàn)MAP2表達增加可抑制腫瘤細胞的遷移及侵襲能力［16］，前期研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中MAP2表達陽性者預后較好［17］，可能原因是MAP2通過穩(wěn)定微管導致細胞周期停滯而抑制細胞分裂。同時，Song等［16］發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞中腺病毒轉(zhuǎn)染MAP2使其表達增加，導致黑色素瘤細胞凋亡及細胞周期停滯。黑色素瘤與PNETs具有相似的生物組織學特性［10］，可部分解釋本研究結果。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)Ki-67指數(shù)與MAP2表達之間存在相關性，而Ki-67指數(shù)為腫瘤細胞增殖分化的重要指標，是PNETs患者預后的獨立預測因素［4］。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌分化的腫瘤中MAP2的表達增加似乎是一個抑癌因素，可能作為腫瘤治療的靶點。

MAP1B在生長發(fā)育階段表達水平較高而在發(fā)育成熟時表達水平較低［18］。MAP1B可與多種蛋白質(zhì)如微管蛋白結合。MAP1B還可抑制p53的轉(zhuǎn)錄，推測其可能在腫瘤形成中發(fā)揮作用［19］。然而，本研究尚未發(fā)現(xiàn)MAP1B的表達與PNETs患者的臨床病理特征及預后相關。

Scarpa等［20］發(fā)現(xiàn)PNETsⅠ期患者與Ⅳ期患者的5年生存率分別為100%和35%。在10年的隨訪時間里僅1例Ⅰ期患者死于腫瘤而Ⅳ期患者的死亡率高達82%［20］。另一項歐洲的研究結果與此相符，該研究共納入1 072例PNETs患者，248例Ⅰ期患者中僅1例（0.4%）死于腫瘤而半數(shù)以上Ⅳ期患者死于腫瘤［4］。另外，最近977例PNETs患者的回顧性研究也發(fā)現(xiàn)所有的Ⅰ期患者均無病生存，而90%以上的Ⅳ期患者出現(xiàn)腫瘤復發(fā)或死亡［13］。以上結果提示尋找預測Ⅱ、Ⅲ期患者結局的分子標志具有重要臨床意義。

本研究的不足之處在于回顧性研究中一些關鍵的衡量指標無法測量、選擇偏倚及信息偏差、無法得出因果關系等。此外，本研究病例來自于多個各研究中心可能存在一些變異。另外，本研究患者的中位隨訪時間為56個月，而大多數(shù)PNETs患者即使腫瘤復發(fā)總生存時間均>5年。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MAP2的表達可能是預測PNETs患者尤其是Ⅱ、Ⅲ患者總生存的標志物。

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（2017-02-01收稿）

（2017-04-23修回）

（編輯：鄭莉 校對：孫喜佳）

Expression of microtubule-associated protein 2 correlates with better prognosis of pancreatic neuroendocrine tumors

Tiantian SONG1,Yu XIAO2,Chunmei BAI3,Naishi LI4,Jie CHEN5,Dachun ZHAO2,Yuli SONG1,Kaizhou JIN6,Liming ZHU1,Run YU7,Xianjun YU6,Yuanjia CHEN1

Yuanjia CHEN;E-mail:yuanjchen@outlook.com
1Department of Gastroenterology,2Department of Pathology,3Department of Oncology,4Department of Endocrinology,Peking Union Medical College Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730,China;5Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;6Department of Pancreatic Surgery,Fudan University Shanghai Cancer Center,Shanghai 200032,China;7Division of Endocrinology,Cedars-Sinai Medical Center,and Division of Endocrinology,UCLA,David Geffen School of Medicine,Los Angeles 90048,USA
This work was supported by the National Natural Sciences Foundation of China(No.81450015)

Objective:To determine whether microtubule-associated protein 2(MAP2)and microtubule-associated protein 1B(MAP1B)could be prognostic biomarkers for patients with pancreatic neuroendocrine tumors(PNETs).Methods:With immunohistochemical staining,the expressions of MAP2 and MAP1B were examined in 193 and 120 primary tumors and peritumoral tissues,respectively.Then,the relationship between the expression of each protein and clinicopathological characteristics,including prognosis was analyzed.Results:MAP2 and MAP1B were expressed in 88 of 193(45.6%)and 77 of 120(64.2%)tumors,respectively.The expression of MAP2 was significantly associated with the favorable overall survival of patients with PNETs(P=0.012).Moreover,MAP2 expression was associated with the improved overall survival in a subset of patients with stageⅡand stageⅢtumors(P=0.017).The MAP1B expression did not correlate with other clinicopathological features and prognosis.Conclusion:MAP2 could be a novel,independent prognostic biomarker for PNETs.

microtubule-associated protein 2,pancreatic neuroendocrine tumors,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.11.190

①中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科（北京市100730）；②病理科；③腫瘤內(nèi)科；④內(nèi)分泌科；⑤中山大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科；⑥復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺外科；⑦Division of Endocrinology，Cedars-Sinai Medical Center，and Division of Endocrinology，UCLA，David Geffen School of Medicine，Los Angeles，California

*本文課題受國家自然科學基金應急管理項目（編號：81450015）資助

陳原稼 yuanjchen@163.com

宋甜甜 專業(yè)方向為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診治。

E-mail：18701015732@163.com