劉樹虎， 熱比亞木·巴克， 布帕提瑪穆·阿布都克熱穆， 多力坤·買買提玉素甫

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

維吾爾族人群外周血DNA提取質(zhì)量因素分析

劉樹虎， 熱比亞木·巴克， 布帕提瑪穆·阿布都克熱穆， 多力坤·買買提玉素甫

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

使用改良鹽析法、改良酚/氯仿法、改良碘化鉀法和試劑盒法，分別對(duì)在-80 ℃保存1～4年的維吾爾族人群血樣提取DNA，分光光度儀檢測(cè)DNA濃度和純度，0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，提取的DNA質(zhì)量采用單因素方差分析比較。結(jié)果表明，改良碘化鉀法提取DNA質(zhì)量最好，其次是試劑盒法、酚/氯仿提取法，鹽析法提取質(zhì)量最差；凍存1～4年的血樣提取的DNA濃度之間差異極顯著(F=618.011，P=0.000)，凍存1～4年的血樣提取的DNA純度之間差異極顯著(F=27.090，P=0.000)。該研究基于經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、方便操作，提取DNA質(zhì)量的高低可以確定改良碘化鉀法提取DNA質(zhì)量最好；血樣本凍存(-80℃)超過3年對(duì)提取的DNA質(zhì)量有顯著的影響。

維吾爾族人群； 凍存外周血； DNA提?。?DNA質(zhì)量； 單因素方差分析

隨著技術(shù)的進(jìn)步,人類的遷徙、演變、遺傳變異的藍(lán)圖已經(jīng)越來越清晰地展現(xiàn)在人們的眼前。生物學(xué)、遺傳學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等越來越多的學(xué)科領(lǐng)域都離不開基因分析技術(shù)。因此如何快速、經(jīng)濟(jì)地從外周血中提取高產(chǎn)量、高純度的基因組DNA已成為首要的問題,也是后續(xù)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵[1-3]。目前,外周血DNA的提取方法較多,如:常規(guī)酚/氯仿提取法、碘化鉀法等[4-7],了解各種方法的特點(diǎn)并熟練運(yùn)用一種快速有效的DNA提取方法是無可非議的,但是一些高新設(shè)備儀器、尖端試劑盒的出現(xiàn)使人們漸漸把傳統(tǒng)的技術(shù)方法拋之腦后,隨之帶來的是一些傻瓜式的操作、鐵定的實(shí)驗(yàn)流程,人的實(shí)驗(yàn)操作能力日益衰減。不得不承認(rèn)高新技術(shù)給我們帶來快捷與便捷,但是傳統(tǒng)的技術(shù)方法也有它的優(yōu)勢(shì)。為此,本研究比較了4種常用的全血基因組DNA提取方法各自的提取效果,并最終選定傳統(tǒng)的改良碘化鉀法為本室提取血液基因組DNA最優(yōu)方法,并進(jìn)一步探索了血液凍存時(shí)間對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響,為初步開展分子生物學(xué)工作的科研工作者參考。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用血液樣本來自本研究室超低溫冰箱內(nèi)所保藏的樣品,樣品均為近5年采自維吾爾人群,取樣時(shí)間和地點(diǎn)等信息都有詳細(xì)記錄。

1.2 提取方法

1.2.1 改良酚/氯仿法

改良酚/氯仿法[8-9]：取EDTA-Na2抗凝凍存血300 μL于2.0 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min;棄上清,加雙蒸水1.5 mL溶解,12 000 r/min離心2 min；棄上清,加6 mol/L的NaI 溶液90 μL,充分振蕩；再加20 μL 15%的SDS 和200 μL 5mol/L NaCl,充分振蕩后加入350 μL雙蒸水和600 μL的酚/氯仿/異戊醇混合物(體積比為25∶24∶1),搖勻，靜止一會(huì)，12 000 r/min離心10 min,并重復(fù)一次；取上清700 μL,加等體積預(yù)冷無水乙醇,顛倒離心管至DNA絮狀沉淀出現(xiàn),12 000 r/min離心5 min；棄上清,加1 mL 70%乙醇洗滌DNA沉淀,12 000 r/min離心5 min,重復(fù)洗滌一次；棄上清,將EP管置于室溫干燥10 min,待DNA沉淀干燥后加50 μL無菌TE液溶解備用。

1.2.2 改良鹽析法

改良鹽析法[10-12]：取EDTA-Na2抗凝全血300 μL于2.0 mL離心管中,加入細(xì)胞裂解液1 mL,5 000 r/min離心5 min；棄去上清,向沉淀中加入700 μL冷洗液(140 mol/L NaCl,0.5 mol/L KCl,0.25 mol/L Tris-HCl),吹打沉淀均勻,5 000 r/min離心10 min；棄上清,加入冷洗液700 μL、蛋白酶K35 μL,振蕩混勻后置于65 ℃ 1 h,期間振蕩幾次；取出后加入1 mL 5 mol/L NaCl 劇烈振蕩,12 000 r/min離心5 min；將上清轉(zhuǎn)移至2個(gè)新離心管中,加入等體積無水乙醇充分混勻,12 000 r/min離心5 min；棄上清,將兩個(gè)離心管中絮狀DNA沉淀合并成至同一管中,向管中加入1 mL 70%乙醇洗滌DNA沉淀,12 000 r/min離心5 min；重復(fù)該步驟一次；棄上清,瞬時(shí)離心后將離心管管底乙醇吸出,置于室溫干燥10 min,待DNA沉淀干燥后加50 μL無菌TE液溶解備用。

1.2.3 改良碘化鉀法

改良碘化鉀法[13-14]：取EDTA-Na2抗凝全血300 μL加至2.0 ml離心管中,加雙蒸水1 500 μL，12 000 r/min離心3 min；棄上清，加60 μL 5 mol/L KI,旋渦振蕩30 s; 0.9% NaCl 300 μL, 500 μL氯仿/異戊醇(體積比為24∶1),振蕩30 s ;12 000 r/min離心5 min;吸上清100 μL于另一離心管中,加異丙醇60 μL,輕輕混勻,12 000 r/min離心5 min；棄上清，加冷無水乙醇1 000 μL,12 000 r/min離心5 min;棄去無水乙醇,室溫干燥10 min;待DNA沉淀干燥后加50 μL無菌TE液溶解備用。

1.2.4 試劑盒提取法

購自Genview公司(GV-Whole blood genomic DNA extraction Kit),參照試劑盒內(nèi)提供的說明書步驟進(jìn)行提取。

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA電泳檢測(cè)

用0.8%瓊脂糖凝膠電泳(含核酸染料)對(duì)4種方法提取的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。分別取8 μL DNA提取樣品,加入2 μL上樣緩沖液混合點(diǎn)樣。電泳條件為100 V、85 mA,電泳30 min左右,電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.3.2 DNA純度檢測(cè)

各取1 μL提取的基因組DNA樣品,以無菌TE液為空白對(duì)照,紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-2501)測(cè)定基因組DNA的含量及波長為260 nm和280 nm的吸光度值(A260、A280)。根據(jù)A260/A280的比值來判斷DNA的純度:A260/A280<1.8說明樣品中存在蛋白質(zhì)污染,A260/A280介于1.8～2.0之間說明樣品較純,A260/A280>2.0說明樣品中存在RNA污染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)輸入Excel表格,使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間差異采用單因素方差分析,P<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定4種方法提取的基因組DNA的紫外吸收峰,在260 nm處呈吸收高峰,為典型的DNA紫外吸收峰。

2.2 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

4種方法提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)可見DNA電泳條帶均勻、整齊且都處于Mark分子量23 kb條帶的上方位置。改良鹽析法和試劑盒法在點(diǎn)樣孔周圍發(fā)亮，有樣品滯留現(xiàn)象,而改良碘化鉀法和改良酚/氯仿法的點(diǎn)樣孔處很干凈,無發(fā)亮現(xiàn)象。電泳檢測(cè)還發(fā)現(xiàn),鹽析法提取的基因組DNA條帶明顯沒有另外3種方法提取的基因組DNA條帶明亮,并且試劑盒法提取的基因組DNA還存在輕微的拖尾現(xiàn)象(見圖1)。凍存1～2年的外周血提取的DNA條帶比凍存3～4年的條帶要厚且亮。且凍存1年的外周血DNA條帶明顯優(yōu)于凍存2年及以上的樣品(見圖2)。

圖1 4種方法提取DNA電泳圖

圖2 改良碘化鉀法提取不同凍存時(shí)間外周血的DNA電泳圖

2.3 DNA質(zhì)量分析

2.3.1 4種方法提取基因組DNA濃度和純度比較

4種方法提取DNA測(cè)定的A260/A280值和DNA質(zhì)量濃度和純度經(jīng)單因素方差分析表明,A260/A280值差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.859)；4種方法提取DNA的濃度差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(見表1，表中N為樣本量)。

表1 提取DNA的質(zhì)量濃度及A260/A280比值(±SD)

注:兩兩比較,**P=0.000,P=0.859。

2.3.2 凍存1～4年的外周血提取DNA濃度和A260/A280值比較

凍存1～4年外周血提取DNA質(zhì)量濃度和純度經(jīng)單因素方差分析表明,差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=618.011,P=0.000；F=27.090,P=0.000)。多重比較顯示,1～3年外周血提取DNA質(zhì)量濃度差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),凍存4年的外周血DNA質(zhì)量濃度與凍存1～3年的外周血DNA質(zhì)量濃度差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。凍存外周血樣提取的DNA質(zhì)量濃度隨凍存時(shí)間的延長而降低，而提取的DNA質(zhì)量純度隨凍存時(shí)間的延長變化不顯著(P>0.05)。(見表2)

表2 不同年數(shù)凍存血提取DNA的質(zhì)量濃度及A260/A280值比(±SD)

注:兩兩比較,**P=0.000<0.05。

3 討論

提取基因組DNA的方法多種多樣[1-14],選擇快速、經(jīng)濟(jì)、安全、高效的方法提取高產(chǎn)量、高純度的基因組DNA是所有分子生化后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基石。鹽析法以其簡單快速的優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[15],提取過程中使用的化學(xué)試劑較少,但血液樣本消化裂解要用昂貴的蛋白酶K且用量相對(duì)較多[16]，而且質(zhì)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)提取的基因組DNA濃度和純度都很低,雜質(zhì)蛋白含量較高，從經(jīng)濟(jì)、時(shí)間和實(shí)驗(yàn)結(jié)果等方面考慮,不認(rèn)為鹽析法是一種很好的提取血液基因組DNA的方法。

酚/氯仿法操作過程較復(fù)雜,在提取過程中進(jìn)行了改良,SDS和NaI的加入使核膜破裂徹底保證DNA釋放完全,加快蛋白質(zhì)變性去除,同時(shí)DNA酶活性降低減少DNA被降解[17]；反復(fù)抽提使細(xì)胞碎片,蛋白等雜質(zhì)去除干凈,從而提高DNA的濃度和純度。

碘化鉀法用雙蒸水溶解紅細(xì)胞，加長溶解時(shí)間使紅細(xì)胞完全溶解,有效減小血紅蛋白對(duì)PCR擴(kuò)增的影響；70%乙醇洗滌可去除鹽離子,碘化鉀裂解白細(xì)胞膜、核膜釋放DNA，得到DNA在濃度與純度上都能滿足后續(xù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)且用血量少,成本低，適合提取大批量臨床實(shí)驗(yàn)樣品[13]。

試劑盒法操作簡捷快速,DNA產(chǎn)量和濃度都很高,省去了試劑的配制，減小了因試劑配制不準(zhǔn)確造成的問題,應(yīng)用也很廣泛[18]；但實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)得到DNA的沉淀較渾濁,提取過程中容易使基因組DNA的降解,導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。其提取到DNA的濃度和純度比酚/氯仿法及碘化鉀法相比并不明顯,再考慮到成本試劑盒法不適宜提取大批量的樣本基因組DNA。

提取方法是影響DNA質(zhì)量的主要因素,在日常工作中要適當(dāng)追求新的方法，但不要摒棄傳統(tǒng)的方法,比如在本研究中碘化鉀法就比試劑盒法有明顯的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然為了得到高質(zhì)量的DNA必須從源頭開始,比如：樣品采集要采靜脈血而避免采取動(dòng)脈血；血樣采集后要迅速低溫保藏，且盡量采血時(shí)就按實(shí)驗(yàn)需要分成若干小管,避免實(shí)驗(yàn)時(shí)反復(fù)凍融血樣；盡量保藏在超低溫冰箱內(nèi),盡可能快提取基因組DNA；分離白細(xì)胞法要比裂解紅細(xì)胞法提取的DNA質(zhì)量高等。通過本實(shí)驗(yàn)確定了本實(shí)驗(yàn)室提取基因組DNA的最優(yōu)方法為碘化鉀法,為以后的實(shí)驗(yàn)堅(jiān)定了基礎(chǔ),同時(shí)希望通過我們的實(shí)驗(yàn)可以為初學(xué)者提供參考,綜合考慮各種因素,依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要制定自己的提取方案,提高實(shí)驗(yàn)提取質(zhì)量,降低經(jīng)濟(jì)成本。

References)

[1] 唐天樂,高炳森,長孫東亭,等.高質(zhì)量畢赤酵母基因組DNA提取方法比較[J].生物技術(shù)通報(bào),2010,2010(1):196-199.

[2] 閆曉華,高立芬,續(xù)力云.外周血基因組DNA提取方法比較[J].山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2008,30(3):175-177.

[3] 宋小燕,徐兵,李潔.改良國產(chǎn)試劑盒提取血漿DNA的方法[J].廣東醫(yī)學(xué),2008,29(6):906-907.

[4] 孫汶生,曹英林,馬春紅,等.基因工程學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004:284-285.

[5] 吳清敏,劉巧紅,朦云,等.外周血DNA提取方法的比較[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(7):445-446.

[6] Attal J, Cajero-Juarez M, Houdebine L M. Asimple method of DNA extraction from whol e tissues and blood using glass powder for detection of transgennic animals by PCR[J].Transgenic Research,1995,4(2):149-150.

[7] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].2版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.

[8] 王韻,徐冬冬.改良酚/氯仿法提取人全血DNA的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(2):161-162.

[9] 伍新堯,羅超權(quán),楊英浩.基因診斷原理與臨床[M].廣州:中山大學(xué)出版社,1995:8-22.

[10] 王薇,邵超鵬.全血DNA快速提及其在HLA基因型中的應(yīng)用[J].深圳醫(yī)學(xué),1998,11(1):5-7.

[11] 張帥,徐銳,張強(qiáng),等.改良鹽析法提取全血基因組DNA的影響因素研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(35):42-46.

[12] 林經(jīng)東,黃健文,林經(jīng)安,等.三種提取血液DNA方法的比較[J].中華醫(yī)學(xué)寫作雜志,2002,9(6):488-490.

[13] 趙書平,張俊潔,尤建,等.一種碘化鉀提取外周血基因組DNA的方法[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué),1999,16(6):395-396.

[14] 涂向東,江清華,蘭風(fēng)華.三種簡易提取全血基因組DNA方法的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2006,10(3):264-266.

[15] Nasiri H, Forouzandeh M, Rasaee M J,et al.Modified salting-out method:high-yield,high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent[J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2005,19(6):229-232.

[16] 賈二娟,朱偉鋒,余樂涵.蛋白酶K對(duì)鹽析法提取全血DNA的影響[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011, 29(3):263-264.

[17] 杜金子,陳麗梅,黃榮韶,等.改良SDS法提取石韋基因組DNA的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,22(3):754-758.

[18] 李曉曉,趙煥英,楊云廷,等.三種人全血基因組DNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(27):5221-5225.

Analysis on quality factors of DNA extracted from peripheral blood of Uygur population

Liu Shuhu, Rebiyamu Bake, Bupatima Abudukeremu, Duolikun Maimaitiyusufu

(College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Objective: It is to analyze the factors affecting the quality of DNA extracted from the genomic DNA of whole blood frozen samples in Uygur population by different samples and freezing time. Methods: The blood samples at-80 ℃ for 1-4 years are extracted by the modified salting-out method, the modified phenol/chloroform method, the KI method and reagent box method. The concentration and purity of DNA are detected by the spectrophotometer and 0.8% agarose gel electrophoresis, and the extracted DNA quality is compared by the single factor variance analysis. Results: The improved KI method is the best to extract DNA, followed by the reagent box method and phenol/chloroform method, and the extraction quality by the salting-out method is the worst. The concentration of DNA extracted from the frozen blood samples for 1-4 years is significantly different (F=618.011,P=0.000) and so is its purity(F=27.090,P=0.000). Conclusion: The research is based on economic benefit and easy operation. The quality of DNA can be determined by the improved KI method, and the blood samples frozen (-80 ℃) for more than 3 years have significant effect on the quality of extracted DNA.

Uygur population; frozen peripheral blood; DNA extraction; DNA quality; single factor variance analysis

10.16791/j.cnki.sjg.2017.05.017

2016-11-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“新疆隔離人群的遺傳多樣性研究及流行病學(xué)資源數(shù)據(jù)庫建立”(31460285)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目“新疆阿爾克孜族隔離人群減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)遺傳定位研究”(2013211A016)；中國科學(xué)院計(jì)算生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2014KLCB02)

劉樹虎(1989—)，男，山東莒南，碩士研究生，研究方向?yàn)槿祟惙肿舆z傳學(xué)

多力坤·買買提玉素甫(1960—)，男(維吾爾族)，新疆烏魯木齊，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槿祟惻c醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué).

Q987

B

1002-4956(2017)5-0064-04