朱 琳，章智華，謝鳳英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定月餅中黃曲霉毒素B1

朱 琳，章智華，*謝鳳英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

采用酶聯(lián)免疫法對(duì)月餅中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)該方法的線性、靈敏度、回收率和重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品在1.00～50.00 g/kg范圍內(nèi)線性良好，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4，該方法對(duì)黃曲霉毒素B1的最低檢出含量為1.00 g/kg，不同含量添加所得回收率為96.7%～105.0%，重復(fù)性好，精密度為1.96%。通過對(duì)9個(gè)不同產(chǎn)品特性月餅中黃曲霉毒素B1的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有樣品均有檢出，但黃曲霉毒素B1的含量均小于5.00 g/kg。結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法測(cè)定快速、定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可高效率地定量檢測(cè)大量市售月餅中黃曲霉毒素B1的含量。關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫法（ELISA）；黃曲霉毒素B1；月餅

黃曲霉毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉、煙曲霉和少數(shù)溫特霉菌株產(chǎn)生，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素衍生物。目前，分離鑒定出的天然黃曲霉素主要類型為B和G毒素，包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2），其中以黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)。1993年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義黃曲霉毒素B1為一類致癌物，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，尤其對(duì)人和動(dòng)物肝臟具有極強(qiáng)致癌性[1]。毒理學(xué)研究表明，黃曲霉毒素的危害還包括導(dǎo)致機(jī)體免疫力低下、致畸和致突變性。根據(jù)GB 2761—2011食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量規(guī)定，稻谷、糙米、大米及其制品中黃曲霉毒素B1限量為10 g/kg，小麥、大麥、其他谷物及其制品的限量為5 g/kg，嬰幼兒配方食品和輔助食品限量為0.5 g/kg。歐盟國(guó)家規(guī)定更為嚴(yán)格，要求加工谷類食品和嬰兒食品中黃曲霉毒素B1的含量不能超過0.1 g/kg，因此及時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素B1已成為世界各國(guó)都非常重視的問題。

目前，食品中應(yīng)用比較廣泛的黃曲霉毒素檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析技術(shù)（LC-MS/MS）等。HPLC和LC-MS/MS方法雖然定量準(zhǔn)確，但是樣品前處理一般需特定的凈化柱，凈化柱價(jià)格相對(duì)較高，同時(shí)需要配置價(jià)格昂貴的檢測(cè)儀器，操作人員需專門經(jīng)過儀器培訓(xùn)；而酶聯(lián)免疫法（ELISA）只需要全掃描酶標(biāo)儀，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，檢測(cè)人員容易上手，在許多企業(yè)和小型檢測(cè)機(jī)構(gòu)得到了廣泛應(yīng)用。月餅因含有大量油脂、糖分、蛋白質(zhì)，黃曲霉毒素B1污染可能性較大[2]。由于月餅節(jié)令性較強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)需完檢，試驗(yàn)利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）以月餅為樣本，檢測(cè)了當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)中隨機(jī)抽取月餅中黃曲霉毒素B1的含量，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行有效評(píng)估[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

月餅，隨機(jī)購(gòu)于廣東省某超市，品種包括五仁、蛋黃蓮蓉、水果、火腿4種口味，各8批次共32批次；甲醇、三氯甲烷、無水硫酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器

Thermo multiskan MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品；HY-5型水浴恒溫回旋振蕩器，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；恒溫干燥箱，德國(guó)BINDER公司產(chǎn)品；黃曲霉毒素B1檢測(cè)試劑盒，德國(guó)R-Biopharm拜發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法與步驟

1.3.1 樣品前處理方法

參照國(guó)標(biāo)（GB/T5009.22—2003），準(zhǔn)確稱取20.0 g粉碎樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL的甲醇-水（55∶45）提取液和30 mL正己烷，振蕩30 min，過濾于125 mL分液漏斗中，靜置分層，取下層清液于燒杯中，準(zhǔn)確量取20 mL三氯甲烷，加塞振蕩2 min，靜置分層，經(jīng)盛有約10 g預(yù)先用三氯甲烷潤(rùn)濕的無水NaSO4定量快速濾紙過濾于蒸發(fā)皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)提取，將三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量的三氯甲烷洗滌無水Na2SO4過濾器，洗液濾于蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥于65℃水浴揮干，用10 mL甲醇-PBS（2∶8）將凝結(jié)物分3次溶解，制作樣品提取液。

1.3.2 檢測(cè)步驟

將測(cè)試盒放置于室溫中30 min，平衡至室溫25℃；準(zhǔn)確加入1.5 mL酶標(biāo)抗原稀釋液，充分溶解，稀釋為試驗(yàn)用酶標(biāo)抗原溶液，于2～8℃下保存；取適量濃縮洗滌液，用蒸餾水稀釋20倍，作為試驗(yàn)用洗滌液。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)詳細(xì)步驟如下：①根據(jù)待測(cè)樣品量，截取相應(yīng)酶標(biāo)板孔數(shù)，每孔加入250 L洗滌液洗滌，放置1 min后甩掉洗滌液，在吸水紙上排干，重復(fù)洗板1次。②依次加入配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液和月餅樣品提取液50 L，除儀器調(diào)零孔加入50 L酶標(biāo)抗原稀釋液外，其余各孔均加入50 L酶標(biāo)抗原溶液。③將反應(yīng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。④取出反應(yīng)板，用力甩掉反應(yīng)液，拍干后，每孔加入250 L洗滌液洗滌，重復(fù)洗板4次。⑤每孔加入顯色底物液A和B，搖勻，將反應(yīng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色15 min。⑥顯色結(jié)束后，每孔加入50 L終止液，搖勻后用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔的吸光度。

1.3.3 方法評(píng)價(jià)

從方法的線性、回收率、靈敏度、重現(xiàn)性4個(gè)方面，對(duì)月餅中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫法進(jìn)行方法評(píng)價(jià)。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

樣品中黃曲霉毒素B1含量按式（1）計(jì)算：

式中：W——試樣中黃曲霉毒素B1含量，g/kg；

C——樣品液中黃曲霉毒素B1含量，g/kg；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

D——稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法篩選

對(duì)于月餅的前處理方法，試驗(yàn)測(cè)試了2種提取溶劑，一種是以甲醇為提取溶劑，分別設(shè)置甲醇與水的體積比為1∶1和7∶3；另一種是三氯甲烷。通過比較，用三氯甲烷作為提取溶劑，回收率達(dá)標(biāo)，本底值偏低，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小，最后選定三氯甲烷作為提取溶劑。

2.2 線性

將系列黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 g/L）測(cè)得的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)值（lgC），縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)液吸光度與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液孔吸光度的比值，得線性方程Y=-40.291C+88.365，黃曲霉毒素B1在0～50.00 μg/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 靈敏度測(cè)定

按照試驗(yàn)步驟，通過依次添加黃曲霉毒素B1到樣品中，降低黃曲霉毒素B1于波長(zhǎng)450 nm處的光密度來確定最低檢測(cè)濃度，即檢測(cè)的靈敏度。

黃曲霉毒素B1靈敏度試驗(yàn)見表1。

由表1可知，黃曲霉毒素B1含量為1.00 g/kg時(shí)，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處的吸光度為1.812。與黃曲霉毒素B1為0時(shí)的吸光度1.714之差大于0.1，此值可確定為此方法的靈敏度，由于對(duì)黃曲霉毒素B1的最低檢出量為1.00 g/kg，因此將月餅黃曲霉毒素B1的檢測(cè)靈敏度確定為1.00 g/kg。

2.4 回收率

選2#月餅樣品作為添加回收試驗(yàn)樣品，分別添加0，1.5，3.0，5.0 g/kg，按照試驗(yàn)步驟測(cè)定添加樣品中黃曲霉毒素B1含量，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，樣品的加標(biāo)回收率在95%左右。

黃曲霉毒素B1回收率試驗(yàn)見表2。

表1 黃曲霉毒素B1靈敏度試驗(yàn)

表2 黃曲霉毒素B1回收率試驗(yàn)

2.5 重現(xiàn)性

按照試驗(yàn)檢測(cè)步驟重復(fù)測(cè)定月餅中黃曲霉毒素B1的含量6次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

黃曲霉毒素B1重現(xiàn)性試驗(yàn)見表3。

表3 黃曲霉毒素B1重現(xiàn)性試驗(yàn)

由表3可知，多次樣品測(cè)定的平均值為1.441，標(biāo)準(zhǔn)差為0.03%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%，重現(xiàn)性能夠滿足分析方法的要求。

2.6 不同品種月餅中黃曲霉毒素B1的含量

選取目前市場(chǎng)上消費(fèi)較多的五仁、蛋黃蓮蓉、水果、火腿4類月餅樣品，樣品編號(hào)1～9測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。

月餅中黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定見表4。

表4 月餅中黃曲霉毒素B1含量的測(cè)定

由表4可知，9個(gè)隨機(jī)購(gòu)買的月餅樣品中均檢出黃曲霉毒素B1[4]，其中3個(gè)樣品黃曲霉毒素B1含量小于0.5 g/kg，4個(gè)樣品黃曲霉毒素B1含量為0.5～1.0 g/kg，2個(gè)樣品黃曲霉毒素B1含量大于1.0 g/kg且小于2.0 g/kg。總體來看，隨機(jī)購(gòu)買的月餅樣品中黃曲霉毒素B1含量低。參考食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2761—2011），抽取的9個(gè)月餅樣品中黃曲霉毒素B1含量均未超標(biāo)。

3 結(jié)論

在測(cè)定的9個(gè)月餅樣品中，雖然黃曲霉毒素B1含量沒有超出標(biāo)準(zhǔn)，但是檢出率達(dá)100%，由此觀之，月餅作為一種受歡迎的食品，存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。月餅因含有大量油脂、糖分、蛋白質(zhì)，黃曲霉毒素B1污染可能性較大。

[1]Liu S W，Bai F，Li，et al.Investigation on AFB1toxin contamination in the pig feed in Southwest China[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine，2016，48（3）：51-54.

[2]管笛，亢子佳，賈迪，等.磁性酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素B1[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（5）：101-105.

[3]吉小鳳，陳笑蕓，魏巍.酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定瓶裝黃酒中黃曲霉毒素B1[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（11）：2 006-2 010.

[4]邱楊，劉建麗，趙麗.食品中黃曲霉毒素B1的抽查檢驗(yàn)與安全評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（10）：1 055-1 057.◇

Determination of Aflatoxin B1in Chinese Moon Cake by Enzyme-linked Immunosorbant Assay（ELISA）

ZHU Lin，ZHANG Zhihua，*XIE Fengying
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

The content of aflatoxin B1in the moon cakes is measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The linearity，sensitivity，recovery and reproducibility of the method are verified.The linear range of aflatoxin B1standard is 1.00～50.00 μg/kg，Y=-40.291C+88.365，R2=0.998 4.The lowest detectable concentration of aflatoxin B1is 1.00 μg/kg.The recoveries are 96.7%～105.0%with good reproducibility and precision of 1.96%.The results of aflatoxin B1detection show that the contents of aflatoxin B1are less than 5.00 g/kg.The results of enzyme-linked immunosorbent assay show that the method is simple，determination of fast quantitative and accurate，reproducible，and can be highly effective quantitative detection of large quantities of commercially available moon cake in the aflatoxin B1content.

enzyme-linked immunosorbant assay（ELISA）；aflatoxin B1；Chinese moon cake

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.044

1671-9646（2017）05b-0056-03

2017-04-26

朱琳（1997—），女，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：謝鳳英（1975—），女，博士，講師，研究方向?yàn)榧Z食、油脂、植物蛋白質(zhì)工程。