蘭翠娟

(河北省唐山市豐潤(rùn)區(qū)農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局，河北唐山064000)

雙模板分子印跡聚合物-高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中的喹諾酮類藥物

蘭翠娟

(河北省唐山市豐潤(rùn)區(qū)農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局，河北唐山064000)

喹諾酮類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留可能對(duì)消費(fèi)者造成許多健康威脅。因此，中國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)喹諾酮類藥物在多種動(dòng)物源食品中的最高殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，如雞肉中沙拉沙星為10 ng/g。要對(duì)復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，第一步就是要對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化。目前，獸藥殘留分析領(lǐng)域最常用的樣品前處理方法是固相萃取法(SPE)[1-5]。SPE法使用的吸附劑容易受到樣品雜質(zhì)的干擾，可能會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性、非特異性吸附，且多為一次性使用的材料。近年來(lái)，分子印跡聚合物(MIP)作為一種新型材料受到了極大的關(guān)注。它可以耐受不同的極端pH值、高壓和高溫等條件，且可以重復(fù)使用上百次。目前，已有研究者利用不同喹諾酮類藥物為分子模板制備了MIP，如諾氟沙星[6]、培氟沙星[7]、環(huán)丙沙星[8]、氧氟沙星[9]、恩諾沙星[10]和依諾沙星[11]。但由于喹諾酮類藥物的分子結(jié)構(gòu)不同，這些MIP的識(shí)別能力也不同，如基于諾氟沙星的MIP只能識(shí)別諾氟沙星，而基于氧氟沙星的MIP能識(shí)別6種藥物。另外，這些MIP均是以單一分子為模板制備的。在本試驗(yàn)中，作者挑選了幾種喹諾酮類藥物組成了三組配對(duì)，以它們作為分子模板制備了3種雙模板MIP，并評(píng)估其識(shí)別能力。然后制備一種MIP-SPE柱對(duì)雞肉中的喹諾酮類藥物進(jìn)行提取和凈化，用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；功能單體甲基丙烯酸和引發(fā)劑2,2-偶氮二乙腈，購(gòu)自Kermer Chemical公司；交聯(lián)劑2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯，購(gòu)自上海阿拉丁公司；液相色譜級(jí)乙腈，購(gòu)自美國(guó)Dikma公司。喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液由甲醇配制(10.0 μg/mL)，系列濃度的工作液由純水稀釋而成(1-1 000 ng/mL)。

1.2 HPLC系統(tǒng)條件 HPLC系統(tǒng)由Waters 1525液相色譜、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器(Waters，USA)和C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)組成。流動(dòng)相由(A)乙腈和(B)0.05%磷酸組成，雙泵梯度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm和289 nm。梯度洗脫條件為：0～11 min，15%(A)，在4 min內(nèi)線性升高至20%(A)，保持5 min，然后在2 min內(nèi)降至15%(A)，保持3 min。

1.3 合成雙模板MIP 基于三組混合模板分子(洛美沙星+恩諾沙星、沙拉沙星+氧氟沙星、環(huán)丙沙星+沙拉沙星)合成的MIP分別命名為MIP1、MIP2和MIP3。MIP合成過程如下：將2 mmol/L雙模板分子，12 mmol/L功能性單體甲基丙烯酸和12 mL致孔劑氯仿加入到帶蓋的玻璃瓶中，振蕩1 min，超聲處理15 min，并在4 ℃保持過夜。然后，加入0.5 mmol/L交聯(lián)劑和40 mg引發(fā)劑，氮吹10 min，密封，在60 ℃水浴中振蕩24 h以完成聚合。將聚合物粉碎、研磨、過篩得到MIP顆粒。將MIP顆粒置入索式提取器中，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)連續(xù)提取48 h，干燥備用。同時(shí)，按上述方法合成不含模板分子的對(duì)照聚合物(NIP)，用于和MIP比較。

1.4 建立MIP-SPE法 使用對(duì)喹諾酮類藥物識(shí)別能力最佳的MIP制備MIP-SPE柱。稱取50 mg MIP顆粒放入空的含玻璃篩板的PTFE柱中(90 mm×5.6 mm, i.d.)，依次用2 mL甲醇和2 mL純水淋洗。將測(cè)試藥物的溶液分別加到該SPE柱中，用3 mL水洗滌。然后，保留在柱上的藥物用2 mL甲醇/乙酸(9∶1，v/v)洗脫，洗脫液在40℃水浴中蒸發(fā)至干。最后，用甲醇溶解并定容至0.5 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，HPLC檢測(cè)。MIP-SPE柱用3 mL甲醇洗滌后可重復(fù)使用。在試驗(yàn)過程中，對(duì)洗脫條件、柱容量、回收率和再循環(huán)性能等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化測(cè)試。

1.5 樣品制備 稱取2 g勻漿后的雞肉樣品置于20 mL的離心管中，加入10 mL乙腈，劇烈震蕩5 min，然后，10 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到MIP-SPE柱上進(jìn)行純化，最后HPLC檢測(cè)。在空白雞肉中按10～300 ng/g的濃度分別添加不同喹諾酮類藥物，按前述方法進(jìn)行提取、檢測(cè)，計(jì)算該方法的線性范圍、檢測(cè)限(信/噪比=3)、定量限(信/噪比=10)、回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同MIP的吸附能力 在實(shí)驗(yàn)過程中，將7種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 000 ng/mL，1 mL)分別加到用3種雙模板MIP制備的SPE柱上進(jìn)行吸附，以甲醇洗脫，HPLC檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，3種MIP-SPE柱均可同時(shí)吸附這7種喹諾酮類藥物，說明本研究中的雙模板MIP能夠識(shí)別分子結(jié)構(gòu)差異較大的不同藥物。但MIP2-SPE柱對(duì)7種藥物的回收率整體高于其他兩種SPE柱，說明沙拉沙星和氧氟沙星在聚合物表面形成的混合印跡對(duì)喹諾酮類藥物的識(shí)別能力更強(qiáng)。因此，選擇MIP2-SPE柱用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 3種MIP-SPE柱對(duì)喹諾酮類藥物的回收率

2.2 洗脫液的優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)過程中，將7種喹諾酮類藥物的混和標(biāo)準(zhǔn)液(500 ng/mL，1mL)分別加到多個(gè)MIP2-SPE上，用不同的洗脫液進(jìn)行洗脫后，HPLC 檢測(cè)。結(jié)果顯示，含乙酸或氨水的甲醇和乙腈對(duì)7種藥物的回收率(80%～100%)整體高于純甲醇和純乙腈的回收率(70%～92%)，這是因?yàn)榧尤胍宜峄虬彼蟮南疵撘簶O性更高，有利于破壞聚合物和藥物之間形成的親和力，從而獲得更高的回收率。在幾組洗脫液中，用甲醇/乙酸(9∶1，v/v)為洗脫液時(shí)的回收率最高(94%～100%)，因此，選擇該溶液用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 MIP2-SPE柱的性能 在最佳條件下，該萃取柱對(duì)7種藥物的柱容量范圍為4 900～5 040 ng，對(duì)7種藥物回收率均≥93%(表1)，表明該萃取柱可以在很大濃度范圍內(nèi)對(duì)這7種藥物的殘留進(jìn)行提取。另外，為了測(cè)試其重復(fù)使用情況，以沙拉沙星和氧氟沙星為代表藥物，按上述方法對(duì)6根MIP2-SPE柱進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明，在連續(xù)使用50次后，兩種藥物的平均回收率只下降了9%，說明該MIP2-SPE柱非常耐用。為驗(yàn)證該MIP2-SPE柱對(duì)這7種喹諾酮類藥物的吸附是由于特異性識(shí)別，在試驗(yàn)過程中，將MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱進(jìn)行了比較。將7種喹諾酮類藥物和3種其他種類的藥物(四環(huán)素、阿莫西林、蘇丹紅1號(hào))分別加到MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱上進(jìn)行吸附、洗脫。結(jié)果如圖2所示，MIP2-SPE柱對(duì)喹諾酮類藥物的回收率遠(yuǎn)高于對(duì)其他3種藥物的回收率(低于30%)，而NIP-SPE對(duì)這10種測(cè)試藥物的回收率相當(dāng)(約30%)，說明MIP2-SPE發(fā)揮的是特異性識(shí)別作用。

圖2 MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱吸附性能的比較

表1 MIP2-SPE柱性能及MIP-SPE-HPLC檢測(cè)參數(shù)(n=5)

2.4 添加回收試驗(yàn) 在試驗(yàn)過程中，用空白雞肉的提取液分別配制7種喹諾酮類藥物的溶液，經(jīng)HPLC檢測(cè)，以確定該方法的檢測(cè)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。另外，從圖3看出，在空白雞肉的色譜圖中7種藥物的色譜峰周圍沒有其他雜質(zhì)峰，說明該MIP2-SPE的凈化效果令人滿意。為驗(yàn)證該MIP-SPE-HPLC方法的準(zhǔn)確度和精密度，在空白雞肉中按10～300 ng/g的濃度分別添加7種藥物，按前述方法進(jìn)行提取、檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法對(duì)7種藥物的日間回收率為76.5%～91.8%，日內(nèi)回收率為78.0%～93.1%，變異系數(shù)低于11.2%(表2)。以上結(jié)果表明，該MIP-SPE-HPLC可以作為一種簡(jiǎn)便、耐用、準(zhǔn)確的方法用于喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)。

表2 MIP-SPE-HPLC法的準(zhǔn)確度及精密度 (n=6)

2.5 與其他SPE柱的比較 本試驗(yàn)是首次報(bào)道以雙模板MIP制備SPE柱用于喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)。為比較與普通SPE柱的差異，本試驗(yàn)中空白添加樣品的提取液分別用兩種含有不同吸附劑的商品化SPE柱(HLB和C18)進(jìn)行純化，然后HPLC檢測(cè)，重復(fù)3次。結(jié)果表明，商品化HLB柱的回收率(74%～83%)和C18柱的回收率(22%～31%)都比MIP-SPE柱的低。并且這兩種商品化SPE柱的凈化效果也比MIP2-SPE柱差。如圖3所示，使用商品化SPE柱時(shí)，在藥物的色譜峰周圍存在不同的干擾峰，說明它們會(huì)對(duì)樣品中的雜質(zhì)產(chǎn)生非特異性吸附，從而會(huì)干擾對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。

3 結(jié)論

作為一種新型吸附劑，MIP已被用于多種物質(zhì)殘留的提取凈化。本文中制備的雙模板MIP可以用于提取凈化雞肉中的7種喹諾酮類藥物，在識(shí)別藥物數(shù)量方面優(yōu)于已有的相關(guān)報(bào)道，但其對(duì)其他未測(cè)試的本類藥物的識(shí)別性能有待進(jìn)一步研究。如果能夠找到更合適的模板分子，制備能識(shí)別所有此類藥物的MIP，則可以實(shí)現(xiàn)此類藥物更大范圍的殘留監(jiān)控，這也仍有待研究。

圖3 喹諾酮類藥物不同情況下的色譜圖

a：標(biāo)準(zhǔn)品； b：空白雞肉，空白樣品添加藥物后經(jīng)； c：MIP柱； d：HLB柱； e：C18柱凈化(1：氧氟沙星, 2：環(huán)丙沙星, 3：培氟沙星, 4：洛美沙星, 5：恩諾沙星, 6：沙拉沙星, 7：二氟沙星)

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2016-11-17

蘭翠娟(1977-)，女，高級(jí)獸醫(yī)師，本科，從事動(dòng)物檢疫工作，E-mail: weiyinga@126.com

S859

B

0529-6005(2017)04-0099-04