王友鳳，曹云飛，白小英

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 山東 濟(jì)南 250355； 2.莒縣人民醫(yī)院 山東日照 276500；3.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán) 山東 青島 266033 )

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

消喘貼敷膏劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王友鳳1，曹云飛2，白小英3*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 山東 濟(jì)南 250355； 2.莒縣人民醫(yī)院 山東日照 276500；3.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán) 山東 青島 266033 )

為建立消喘貼敷膏劑的質(zhì)量控制方法，本文采用薄層色譜法對(duì)消喘貼敷膏劑中的白芥子、延胡索、細(xì)辛、蓽茇進(jìn)行定性分析。采用高效液相色譜法對(duì)白芥子的芥子堿硫氰酸鹽進(jìn)行含量測(cè)定，色譜柱為Phenomenex Geminin C18色譜柱(150 mm×4.6 mm ，5 μm)，以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。鑒定結(jié)果表明，4味中藥斑點(diǎn)清晰，分離較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。芥子堿硫氰酸鹽在0.84～8.4 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)，平均加樣回收率(n=6)為99.58 %(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.37 %)。該方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于消喘貼敷膏劑的質(zhì)量控制。

消喘貼敷膏劑；薄層色譜法；高效液相色譜法；芥子堿硫氰酸鹽；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

消喘貼敷膏劑是按照傳統(tǒng)中醫(yī)理論組方并結(jié)合現(xiàn)代工藝加工制成的凝膠貼膏劑，由白芥子、延胡索、細(xì)辛、蓽茇4味中藥的超微粉與適宜的基質(zhì)制備而成，具有溫肺化痰、散寒止痛、行氣通絡(luò)之功，主要用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、慢性咳嗽等。目前沒(méi)有對(duì)該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，為了對(duì)該制劑的安全性和有效性進(jìn)行控制，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。本研究利用薄層色譜法對(duì)消喘貼敷膏劑中的白芥子、延胡索、細(xì)辛、蓽茇進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)處方中君藥白芥子的主要藥效成分芥子堿硫氰酸鹽進(jìn)行含量測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為控制消喘貼敷膏劑質(zhì)量的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；KQ100 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JA2003型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；Buchi R215V 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；HHW-4 型雙顯恒溫水浴鍋( 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠)；硅膠G預(yù)制薄層板( 德國(guó)MN公司，批號(hào) 707183)。

白芥子對(duì)照藥材(批號(hào)121150-200502)、延胡索對(duì)照藥材(批號(hào)120928-201208)、細(xì)辛對(duì)照藥材(批號(hào)121204-201405)、蓽茇對(duì)照藥材(批號(hào)121023-201103)、芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品(批號(hào)11702-201504)、延胡索乙素對(duì)照品( 批號(hào) 110726-201515)、細(xì)辛脂素對(duì)照品(批號(hào)111889-201504)、胡椒堿對(duì)照品( 批號(hào)111889-201504)(中國(guó)食品藥品檢定研究院),消喘貼敷膏劑(青島海慈醫(yī)療集團(tuán)制劑室),甲醇(色譜純)、水(超純水)、其他試劑(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 白芥子的鑒別

參照文獻(xiàn)[1-3]的方法，取本品2片，剪碎，加入30 mL甲醇，超聲波處理1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇2 mL使殘?jiān)芙猓鞴┰嚻啡芤?。取白芥子?duì)照藥材1 g加甲醇30 mL，同樣方法制得對(duì)照藥材溶液。另取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去白芥子的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺白芥子的陰性對(duì)照品，同供試品制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液與陰性對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5∶5∶1∶0.5，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上無(wú)干擾 ( 見(jiàn)圖 1)。

2.1.2 延胡索的鑒別

參照文獻(xiàn)[4-5]的方法，取本品2片，剪碎，加濃氨試液1 mL與三氯甲烷20 mL，浸漬1 h，超聲波處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，用甲醇1 mL使殘?jiān)芙?，濾過(guò)，濾液作供試品。取延胡索對(duì)照藥材1 g加濃氨試液1 mL與三氯甲烷20 mL，同供試品制備方法制得對(duì)照藥材溶液。另取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去延胡索的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺延胡索的陰性對(duì)照品，同樣方法法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各4 μL，對(duì)照品溶液1 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中約 5 min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈( 365 nm) 下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上無(wú)干擾 (見(jiàn)圖 2)。

1～3 供試品溶液;4 芥子對(duì)照藥材溶液;5 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液;6 陰性供試品溶液。圖1 白芥子薄層色譜圖Fig.1 TLC of Sinapis semenc

1～3 供試品溶液；4 延胡索對(duì)照藥材溶液；5 延胡索乙素對(duì)照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖2 延胡索薄層色譜圖Fig.2 TLC of orgdalis rhizoma

2.1.3 細(xì)辛的鑒別

參照文獻(xiàn)[6]的方法，取細(xì)辛對(duì)照藥材0.5 g加甲醇30 mL，同供試品制備方法制得對(duì)照藥材溶液。另取細(xì)辛脂素對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去細(xì)辛的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺細(xì)辛的陰性對(duì)照品，同供試品法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取2.1.1項(xiàng)下白芥子供試品溶液以及上述對(duì)照藥材溶液與對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以3%(g/mL)香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至顯色清楚。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上無(wú)干擾 (見(jiàn)圖 3)。

2.1.4 蓽茇的鑒別

參照文獻(xiàn)[7-8]的方法，取蓽茇對(duì)照藥材0.5 g加甲醇30 mL，同供試品制備方法制得對(duì)照藥材溶液。另取胡椒堿對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去蓽茇的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺蓽茇的陰性對(duì)照品，同供試品法制成陰性對(duì)照品溶液。分別吸取2.1.1項(xiàng)下白芥子供試品溶液以及上述對(duì)照藥材溶液與對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各2 μL ，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)10 %的硫酸乙醇，105 ℃加熱至顯色清楚。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上無(wú)干擾(見(jiàn)圖 4)。

1～3 供試品溶液；4 細(xì)辛對(duì)照藥材溶液；5 細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖3 細(xì)辛薄層色譜圖Fig.3 TLC of asari radix et rhizorma

1～3 供試品溶液；4 蓽茇對(duì)照藥材溶液；5 胡椒堿對(duì)照品溶液；6 陰性供試品溶液。圖4 蓽茇薄層色譜圖Fig.4 TLC of piperis longi fructus

2.2 芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

參照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0512測(cè)定[9]， 色譜柱：Phenomenex Geminin C18色譜柱(150 mm×4.6 mm , 5 μm)；以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87，V/V)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為420 μg/mL芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液，精密量取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇制成濃度為210 μg/mL芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液[10]。

2.2.2.2 供試品溶液的制備

取消喘貼敷膏劑每批4貼，去背襯，剪碎，精密稱定，加甲醇50 mL，超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min，濾過(guò)，濾渣再用甲醇同法提取3次，濾液合并。減壓回收溶劑，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得。

2.2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備

取處方中除去白芥子的其他藥味，按照處方比例及工藝制成缺白芥子的陰性對(duì)照品，再將該陰性對(duì)照品按供試品溶液的制備方法制備，過(guò)濾，即得。

2.2.3 專(zhuān)屬性考察

取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，陰性對(duì)照品色譜中，與對(duì)照品和供試品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)干擾色譜峰出現(xiàn)，供試品色譜峰中，芥子堿硫氰酸鹽峰與其他組分分離較好，說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性良好[11]。

圖5 芥子堿硫氰酸鹽高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of sinapine thiocyanate

2.2.4 線性關(guān)系考察

圖6 線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 The standard curve of linear regression

精密量取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液用甲醇稀釋至含芥子堿硫氰酸鹽42.0、52.5、70.0、105.0、210.0、420.0 μg/mL系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖6。芥子堿硫氰酸鹽線性回歸方程為Y=1 512.3X-79.986，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。結(jié)果表明，芥子堿硫氰酸鹽在0.84～8.4 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄相應(yīng)峰面積，芥子堿硫氰酸鹽峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.31 %，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品適量，按“2.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下于0、5、10、15、20、24 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.79 %。結(jié)果表明,供試品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批號(hào)樣品6份，分別制備成供試品溶液，依法測(cè)定芥子堿硫氰酸鹽含量，測(cè)得芥子堿硫氰酸鹽含量平均值為2.32 毫克/貼，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87 %，表明重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的消喘貼敷膏劑樣品6份，分別精密加入一定量的芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品，按“2.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，平行進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽的平均回收率為99.61 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38 %，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 消喘貼敷膏劑中芥子堿硫氰酸鹽的加樣回收試驗(yàn)(n=6)結(jié)果

2.2.9 樣品測(cè)定

分別取3批消喘貼敷膏劑，按“2.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，3批樣品中芥子堿硫氰酸鹽的含量依次為2.33、2.32、2.32 毫克/貼。

3 討論

在供試品制備方面，所制備的白芥子供試品同時(shí)可用于細(xì)辛、蓽撥的薄層色譜鑒別，不僅節(jié)約成本且能提高日常檢驗(yàn)工作效率；含量測(cè)定對(duì)提取方法進(jìn)行考察，結(jié)果表明超聲提取法和加熱回流提取法的提取率沒(méi)有明顯的差異，從操作簡(jiǎn)便的角度出發(fā)選擇超聲提取法。對(duì)超聲提取時(shí)間(10、30、50、70、90 min)進(jìn)行考察，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，30 min即可提取完全，所以選擇超聲提取時(shí)間為30 min。含量測(cè)定流動(dòng)相考察，分別使用乙腈-3%冰醋酸(15∶85,V/V)、乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87,V/V)、乙腈-0.1%磷酸溶液( 35∶65,V/V)作為流動(dòng)相對(duì)本品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明使用乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(13∶87,V/V)為流動(dòng)相時(shí)峰形、分離度均較好。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2015版一部[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 160．

[2]鄧紅, 區(qū)潔雯, 張蜀, 等. 復(fù)方白芥子巴布劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中成藥, 2010, 32(5): 886-888.

[3]范曉雯, 馬清河, 徐建軍. 驅(qū)白白熱斯酊中當(dāng)歸和白芥子的薄層鑒別[J]. 新疆中醫(yī)藥, 2012, 30(5): 58-59.

[4]鄭弘, 許紅瑋. 延胡索不同炮制方法的薄層色譜鑒別對(duì)比研究[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 28 (5): 695-696.

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[7]劉淑貞, 趙俊萍. 檳榔十三味丸中蓽茇薄層色譜鑒別的研究[J]. 北方藥學(xué), 2012, 9(1): 8.

[8]留杰, 張國(guó)梅. 三味白蔻湯中蓽茇的薄層色譜鑒別[J]. 北方藥學(xué), 2012, 9(4): 7.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2015版四部[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.[10] 尹珉, 王宏, 曾祖平, 等. HPLC法測(cè)定喘寧巴布劑中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2010, 16(1): 21-22.

[11] 劉麗芳, 王宇新, 劉雪芳, 等. HPLC法測(cè)定白芥子藥材中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2001, 20(5): 49-51.

Study on the quality standard of Xiaochuan Emplastrum

WANG you-feng1, CAO yun-fei2, BAI xiao-ying3*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355，China; 2.Juxian People′s hospital, Rizhao 276500，China; 3.Qingdao Haici Medical Corp, Qingdao 266033，China)

∶To establish the quality control method of Xiaochuan Emplastrum,Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus in the Xiaochuan Emplastrum were qualitatively analyzed by TLC. The content of sinapine thiocyanate in sinapis semen was determined by HPLC. The chromatographic column was Phenomenex Geminin C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was acetonitrile-0.08 mol/L potassium phosphate monobasic (13∶87,V/V) at the flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength of 326 nm, the column temperature of 25 ℃ and the sample volume of 20 μL. The results revealed that the spots in the TLC identification of Sinapis Semen, Corydalis Rhizoma, Asari Radix et Rhizoma and Piperis Longi Fructus were clear, well separated and without interference by the negative control. The calibration curve of sinapine thiocyanate showed good linearity in the range of 0.84～8.4 μg (r=0.999 7). The average recovery was 99.58 % (n=6,reltive standard deviatior is 0.37 %). This method is rapid, accurate, reliable, and specific, thus it can be used for the effective quality control of the Xiaochuan Emplastrum.

∶Xiaochuan Emplastrum; TLC; HPLC; sinapine thiocyanate; quality standard

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.008

2016-09-01

青島市 2015—2016 年度中醫(yī)藥科研計(jì)劃 (2015-zyy012)

王友鳳(1991—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┛刂茀^(qū)研究、中藥制劑劑型研究，E-mail：714307497@qq.com

*通信作者，白小英。E-mail：baixiaoying72@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0039-06