崔建升，趙德華，段莉麗，王立新，武 彤

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術實驗室，河北石家莊 050018)

利用藻類熒光檢測霧霾的生物毒性研究

崔建升1,2，趙德華1,2，段莉麗1,2，王立新1,2，武 彤1,2

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術實驗室，河北石家莊 050018)

霧霾中污染物成分復雜，單一評價某類污染物無法評估其綜合毒性。為了快速、準確和全面地評價霧霾的綜合毒性，選用微藻葉綠素熒光法進行生物毒性評價。以蛋白核小球藻和銅綠微囊藻為實驗藻，以供暖期的霧霾為研究對象，分別使用溶液吸收法和濾膜稱重法采集霧霾吸收液和總懸浮顆粒物(TSP)。利用水樣熒光檢測儀檢測微藻在受到霧霾吸收液和總懸浮顆粒物浸出液脅迫時的各熒光參數(shù)(Y(Ⅱ)，NPQ，qP，ETR，F(xiàn)v/Fm)的變化情況，并進行對比分析。結果表明，蛋白核小球藻在受到外源性霧霾暴露時表現(xiàn)較敏感，熒光參數(shù)下降明顯，尤其是參數(shù)NPQ在重度污染兩天的霧霾吸收液的影響下分別下降46.3%和40.2%，而銅綠微囊藻只有在總懸浮顆粒物浸出液干擾下才有明顯的表征。因此，選擇蛋白核小球藻的NPQ參數(shù)作為霧霾生物毒性的指標是可行的。

環(huán)境毒理學；生物毒性；藻類熒光；霧霾；蛋白核小球藻；銅綠微囊藻

自2013年成為年度關鍵詞后，霧霾日益受到社會的廣泛關注，這是由于它影響范圍廣，對人體的危害性大。霧霾的危害性主要來自于形成霧霾的細顆粒物(一般指PM2.5)，因PM2.5粒徑小、表面積大、活性強、易附帶有毒和有害物質(例如重金屬、微生物等)，且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠，而對人體健康和大氣環(huán)境質量產(chǎn)生嚴重的不利影響。由于細顆粒物所附帶的污染物種類較多，采用傳統(tǒng)的物理化學分析方法僅可分析單一污染物的濃度,并不能反映共存污染物間的復合生物效應，也就難以直接評價霧霾的毒性特征以及對生態(tài)系統(tǒng)的影響。而生物毒性檢測可以直觀反映霧霾中污染物的整體生物學效應，以此彌補傳統(tǒng)方法的不足[1]。

生物毒性作為污染物的基礎指標之一，是國際普遍采用的綜合性監(jiān)測指標。它可以正確反映出環(huán)境中的污染負荷與生物學效應的關系，直觀地反映污染物對生物種群的綜合毒性[2]。早期有學者發(fā)現(xiàn)，發(fā)光細菌體內的熒光素酶受到毒性物質的抑制會使發(fā)光強度減弱，并且其減弱程度與毒性物質的濃度成一定的線性關系，于是根據(jù)這一現(xiàn)象提出了利用發(fā)光細菌指示污染物毒性的生物毒性檢測方法[3]。該方法在使用初期存在再現(xiàn)性較差、細胞發(fā)光強度本底差異大[4]、檢測期間發(fā)光自然變化幅度較寬、培養(yǎng)條件局限于室內等問題，隨著引入校正因子并對實驗條件下影響因素研究的不斷深入，使得標準偏差降低，重現(xiàn)性增強[5]，但其仍存在一定的局限性，例如不能進行連續(xù)監(jiān)測等。

在水生毒理學研究中，藻類是水體生態(tài)系統(tǒng)中最重要的初級生產(chǎn)者，因其個體微小、繁殖速度快、對環(huán)境毒物敏感性高，被公認為理想的生物指示物[6]；又因其在較短時間內可反映出化學物質對其世代及種群水平的影響，并可直接觀察細胞水平上的中毒癥狀，而得到廣泛應用。利用藻類監(jiān)測環(huán)境污染的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：1)能夠綜合反映環(huán)境污染對生態(tài)系統(tǒng)的影響；2)可直接觀察污染物對生命系統(tǒng)的危害狀態(tài)；3)可早期發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染；4)能監(jiān)測污染物的長期影響。因此，筆者選用藻類作為霧霾生物毒性的指示生物。

葉綠素熒光作為光合作用的天然探針得到了廣泛的研究和應用。葉綠素熒光現(xiàn)象是由傳教士BREWATER于1834年首次發(fā)現(xiàn)[7]。經(jīng)過不斷地發(fā)展，葉綠素熒光技術在微藻環(huán)境脅迫研究中的應用十分廣泛，例如對有機污染物、外源性無機鹽、重金屬離子等環(huán)境因子的監(jiān)測，都可以利用葉綠素熒光作為指標來評價微藻光合作用所受到的影響，從而得出污染物對微藻生物毒性的響應程度[8-9]。EULLAFFROY等[10]在2003年研究了幾種除草劑對斜生柵藻毒性作用的影響，研究結果表明，斜生柵藻在684 nm和735 nm處的葉綠素熒光比值(F684/F735)可作為評價水中抑制光合作用的除草劑毒性的指標，隨著除草劑濃度的增大，F(xiàn)684/F735值也不斷增大，且呈正相關關系。王麗等[11]在2006年利用葉綠素熒光儀測量三角褐指藻的熒光強度，并檢測除草劑莠去津的濃度，發(fā)現(xiàn)熒光強度隨莠去津濃度的增大而增大，并且莠去津的檢出限為0.5 μg/L。冉春秋等[12]在2008年分別采用無硫培養(yǎng)基和添加解偶聯(lián)劑CCCP培養(yǎng)基來研究海水綠藻(Platymonassubcordiformis)光合作用的特征，結果表明在無硫連續(xù)光照期間,光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)可保持較高放氧活性，加入解偶聯(lián)劑CCCP后，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)光化學活性明顯被抑制。王琳等[13]在2015年利用浮游植物熒光儀研究了不同濃度的重金屬離子溶液對斜生柵藻的6個葉綠素熒光特性參數(shù)的影響,結果表明隨著脅迫時間的延長，PSⅡ最大光能轉化效率(Fv/Fm)下降，且下降幅度隨時間的延長而逐步增大。

本文采用富集(濃縮)采樣法和重量法(HJ 618—2011《環(huán)境空氣 PM10和PM2.5的測定 重量法》)對霧霾吸收液和總懸浮顆粒物進行采集，并測定了微藻在霧霾吸收液和總懸浮顆粒物浸出液影響下的熒光參數(shù)值，主要對Y(Ⅱ)，NPQ，qP，ETR，F(xiàn)v/Fm等5種熒光參數(shù)的變化進行了統(tǒng)計，從而可以得出微藻光合作用受到的影響程度，最終可快速準確地指示霧霾對微藻的生物毒性。

1 材料與方法

1.1 儀器與實驗材料

1.1.1 儀器

主要儀器設備：水樣葉綠素熒光儀(德國沃爾茲公司提供)，大氣采樣器(青島嶗應環(huán)境科技有限公司提供)，人工氣候箱(天津市泰斯特儀器有限公司提供)，熒光顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司提供)。

1.1.2 實驗藻種及培養(yǎng)條件

因蛋白核小球藻和銅綠微囊藻2種微藻具有對毒性物質響應敏感、實驗室易培養(yǎng)的優(yōu)點，被廣泛用于毒性檢測，所以本實驗選擇這2種藻作為實驗的供試藻。蛋白核小球藻和銅綠微囊藻均取自中國科學院野生藻種庫。

將適量藻液接種到無菌的BG11培養(yǎng)基中，進行預培養(yǎng),取對數(shù)期的藻液進行實驗。培養(yǎng)條件：溫度為(25±1.0)℃，濕度為75% RH，光照為2 000 lx,時間設置為12 h(晝)/12 h(夜)。藻種靜置培養(yǎng)，每日定時人工搖動培養(yǎng)瓶2次，同時更改培養(yǎng)瓶位置，以免引起光照不足。

1.2 實驗方法

1.2.1 霧霾提取物的采集

1)霧霾吸收液的采集

在污染天氣下，量取20 mL的蒸餾水放入大氣采樣器的吸收瓶，連接裝置，進行大氣吸收液的采集，采集時間為24 h，得到霧霾吸收液，并同時記錄采樣期間的空氣質量情況。

2)總懸浮顆粒物的采集

在污染天氣下，利用大氣采樣器進行總懸浮顆粒物(TSP)的采集，采集時間為24 h。采樣前后對采樣膜進行稱重，根據(jù)儀器給出的標準采樣體積，得出當天的TSP的質量濃度，并同時記錄采樣期間的空氣質量情況。

1.2.2 霧霾對藻類熒光效應影響的測定

1)霧霾吸收液對藻類熒光效應影響的測定

在微藻生長對數(shù)期(即培養(yǎng)5～6天)，取藻液與霧霾吸收液按體積比1∶1進行混合并搖勻，同時設置空白組(蒸餾水代替吸收液)對照?；旌弦航?jīng)暗置15 min后，用水樣葉綠素熒光儀測定藻液葉綠素熒光動力學參數(shù)，包括光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉化效率(Fv/Fm)、光系統(tǒng)Ⅱ的實際光能轉化效率(Y(Ⅱ))、光合電子傳遞速率(ETR)、光化學淬滅(qP)和非光化學淬滅(NPQ)，取其穩(wěn)定值并記錄，對比空白組與實驗組各熒光參數(shù)的差異，得出霧霾吸收液對微藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

2)總懸浮顆粒物對藻類熒光效應影響的測定

將采集的顆粒物濾膜剪碎后浸泡于100 mL蒸餾水中，30 min后過濾，得到TSP浸出液。將浸出液和微藻培養(yǎng)液按體積比1∶5加入到100 mL藻液中，以脅迫處于對數(shù)期生長的微藻，并同時設置空白組(蒸餾水代替吸收液)對照?；旌弦号囵B(yǎng)7天。實驗開始后每天固定時間取0.1 mL的藻液，用浮游生物計數(shù)框在顯微鏡下計數(shù)。同時，利用水樣葉綠素熒光儀測定藻液葉綠素熒光動力學參數(shù)，記錄藻細胞濃度(生物量)和各熒光參數(shù)在7天內的變化情況。

實驗結果采用數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

采樣期間均為污染天氣，具體空氣質量情況見表1。利用2016-03-04和2016-03-05的霧霾吸收液以及2016-03-16至2016-03-18的TSP浸出液進行實驗。

2.1 霧霾吸收液對微藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

霧霾吸收液對于蛋白核小球藻熒光參數(shù)的影響見表2。從表中可以看出，霧霾吸收液對于蛋白核小球藻的熒光參數(shù)均有抑制作用，對比表3中各熒光參數(shù)的抑制率，可以發(fā)現(xiàn)，在霧霾吸收液的影響下Y(Ⅱ)，ETR，qP，NPQ和Fv/Fm參數(shù)值均有下降，其中NPQ下降明顯。霧霾吸收液對銅綠微囊藻熒光參數(shù)的影響相對較弱(見表4和表5)。

表1 2016年3月4日、5日、16日、17日、18日采樣時的空氣質量情況

注：表中除AQI指數(shù)外，其余參數(shù)的單位均為μg/m3。

表2 霧霾吸收液對于蛋白核小球藻熒光參數(shù)的影響

表3 霧霾吸收液對蛋白核小球藻熒光參數(shù)的抑制率

表4 霧霾吸收液對銅綠微囊藻熒光參數(shù)的影響

表5 霧霾吸收液對銅綠微囊藻熒光參數(shù)的抑制率

2.2 TSP浸出液對微藻生長的影響

2016-03-16至2016-03-18的TSP采樣數(shù)據(jù)如表6所示。

實驗期間將實驗組與空白組進行對比，可知TSP浸出液對2種藻的抑制作用明顯，且隨TSP質量濃度的增大，抑制作用越明顯(見圖1和圖2)，并且2016-03-17樣品的高質量濃度TSP(393.74 μg/m3)對2種藻的抑制作用明顯，培養(yǎng)5天后2種藻細胞密度分別僅為空白組的64%和73%，其余2個樣品(2016-03-16和2016-03-18)所受影響相對較小。7天內，隨著脅迫時間的延長，TSP浸出液對2種微藻的抑制效果沒有持續(xù)增強，說明霧霾顆粒物對2種微藻的持續(xù)性影響并不顯著。

表6 2016年3月16日、17日、18日TSP的采集情況

圖1 TSP浸出液對蛋白核小球藻生長的影響Fig.1 Effect of TSP extract on the growth of Chlorella pyrenoidosa

圖2 TSP浸出液對銅綠微囊藻生長的影響Fig.2 Effect of TSP extract on growth of Microcystis aeruginosa

2.3 TSP浸出液對微藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

實驗期間(1～7天)，空白組和實驗組隨著時間延長，蛋白核小球藻和銅綠微囊藻的Y(Ⅱ)，NPQ，qP，ETR，F(xiàn)v/Fm均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(見圖3和圖4)。實驗開始后，與空白組對比，蛋白核小球藻的NPQ抑制作用明顯。藻細胞經(jīng)過一段時間的適應，對比各參數(shù)，后期蛋白核小球藻的NPQ相比第3天下降尤為明顯，且實驗組與空白組較為一致，分析原因可能與培養(yǎng)溶液中營養(yǎng)物質的耗盡、各類毒性物質的積累和細胞平臺期的到來有關，由此可以得出TSP浸出液對蛋白核小球藻生長前期的影響較大。

圖3 TSP浸出液對蛋白核小球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.3 Effect of TSP extract on chlorophyll fluorescence parameters of Chlorella pyrenoidosa

同時發(fā)現(xiàn)TSP浸出液對Y(Ⅱ)，ETR和qP有較明顯的促進作用，TSP質量濃度越高，促進作用越強。該作用具有持續(xù)性，培養(yǎng)4天后仍具有較明顯的作用。相比之下，蛋白核小球藻NPQ在培養(yǎng)1天后，實驗組參數(shù)值為空白組的20%～40%，TSP浸出液對2種藻的Fv/Fm均呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用，在非脅迫條件下該參數(shù)變化極小且不受物種和生長條件的影響，在脅迫條件下該參數(shù)下降明顯[14]。

圖4 TSP浸出液對銅綠微囊藻葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.4 Effect of TSP extract on chlorophyll fluorescence parameters of Microcystis aeruginosa

3 討 論

霧霾TSP對2種藻的生長具有不同程度的抑制作用，但即使高濃度的TSP作用7天后，微藻的細胞密度仍可以上升至1.3×106ind/mL(見圖1和圖2)，結果表明高濃度的TSP并沒有完全抑制2種藻的細胞生長和分裂，并且對2種藻沒有致死效應。有研究指出，TSP浸出液中化合物離子成分復雜含有一定的重金屬離子，此外還有其他復雜化合物[15]。由此可以推測，在浸出液中許多復雜化合物容易被藻細胞吸附，隨后可與藻細胞膜結合并進入細胞內部，從而影響微藻的一系列新陳代謝活動，最終可影響藻細胞的生長和分裂。

葉綠素熒光動力學方法可以快速、靈敏、無損傷地研究各種逆境條件下對植物光合生理的影響，通過各種熒光參數(shù)的分析，可以得到光合作用過程中的多種信息[16-17]。Y(Ⅱ)表示光系統(tǒng)Ⅱ的實際光合效率，反映光系統(tǒng)Ⅱ的實際光能轉換效率、實際量子產(chǎn)量；NPQ表示非光化學淬滅，反映光系統(tǒng)Ⅱ吸收的能量用于耗散為熱量的比例，也就是植物耗散過剩光能為熱量的能力，即光保護能力；ETR表示光系統(tǒng)Ⅱ的相對電子傳遞速率,反映經(jīng)過光系統(tǒng)Ⅱ的相對線性電子流速率；qP表示光化學淬滅，反映光系統(tǒng)Ⅱ吸收的能量用于進行光化學反應的比例，而開放態(tài)的光系統(tǒng)Ⅱ反應中心所占的比例反映了光合活性的高低；Fv/Fm表示光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合效率，反映光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉換效率、最大量子產(chǎn)量。

霧霾吸收液在急性毒性實驗中，Y(Ⅱ)，ETR，NPQ，qP和Fv/Fm的值均有所下降?？芍庀到y(tǒng)Ⅱ的熱耗散能力處于較低水平，微藻細胞的光保護能力受到影響，光系統(tǒng)Ⅱ受到了干擾，導致微藻細胞的光化學反應下降以及藻細胞內的NADPH和ATP的形成減少，同時對碳的固定和同化能力下降，最終導致光系統(tǒng)Ⅱ的實際光能轉換效率降低。

霧霾TSP在毒性脅迫實驗中，對2種藻的Y(Ⅱ)，qP，ETR有明顯的促進作用，對NPQ，F(xiàn)v/Fm則表現(xiàn)為抑制，結果表明TSP促進了2種藻的光能轉化效率、實際光合效率和電子傳遞活性。反觀TSP對2種藻的生長抑制，推測出TSP盡管能整體抑制2種藻的生長分裂，但也促進了單個細胞的光合效率。分析認為藻細胞產(chǎn)生了抗逆性以適應新環(huán)境，從而表現(xiàn)出較強的光合效率[16]。有研究發(fā)現(xiàn)藻類在湖水底泥中可以很好地適應低溫環(huán)境，而在高溫條件下也可快速增殖分裂[19]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，低溫下三角褐指藻通過光合作用利用光能的能力受到抑制,影響了光合電子傳遞速率,但是第5天之后開始恢復，推測此現(xiàn)象與三角褐指藻的抗逆性較強有關[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，砷酸鹽在抑制三角褐指藻生長的同時也會促進其光合活性[21]；但同時也有研究結果指出，Cu2+，Zn2+，Cd2+等重金屬和石油泄露在抑制藻類生長的同時又會抑制其光合活性[22-25]。有些污染物脅迫能促進藻類DNA，RNA和蛋白質的合成，而有些污染物的脅迫則會使其降低[26-27]。以上這些結論需要進一步研究，目前可推斷出藻類熒光變化規(guī)律不僅和脅迫物質有關，還與藻類個體之間的特異性差異有關，例如藻類細胞結構及其組成。實驗結果表明，蛋白核小球藻相比銅綠微囊藻，其葉綠素熒光參數(shù)變化明顯(例如參數(shù)NPQ)，這是因為蛋白核小球藻細胞內含有豐富的葉綠素，細胞壁薄而均勻,細胞核明顯，是一種具有高效光合作用能力的球形單細胞淡水藻。因此，蛋白核小球藻對生長環(huán)境變化的敏感性較強，且更適用于對污染物生物毒性的監(jiān)測。

4 結 論

1) 比較2種微藻對霧霾提取物的敏感程度，可以發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻較敏感，因此可以選擇蛋白核小球藻作為霧霾生物毒性的指示藻。

2) 蛋白核小球藻在2016-03-04和2016-03-05兩天受霧霾吸收液的影響，葉綠素熒光參數(shù)NPQ分別下降了46.3%和40.2%，因此，可以選擇蛋白核小球藻熒光參數(shù)NPQ作為對霧霾生物毒性的指示性參數(shù)。

3)TSP浸出液對蛋白核小球藻和銅綠微囊藻的細胞密度抑制作用明顯，并且TSP質量濃度越高，抑制作用越強。

4)TSP浸出液對2種藻的Y(Ⅱ)，qP和ETR參數(shù)有較明顯的促進作用，對NPQ，F(xiàn)v/Fm則表現(xiàn)為抑制，且對NPQ抑制效果尤為明顯。

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Detection of biological toxicity of haze with algae fluorescence

CUI Jiansheng1,2, ZHAO Dehua1,2, DUAN Lili1,2, WANG Lixin1,2, WU Tong1,2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

The comprehensive toxicity of haze cannot be evaluated by evaluating each pollutant separately because haze contains complex components. In order to quickly, accurately and comprehensively evaluate the comprehensive toxicity of haze, Algae chlorophyll fluorescence method is used to assess the biological toxicity. WithChlorellapyrenoidosaandMicrocystisaeruginosaused as experiment algae, and the haze in the heating period as the research object, the solution absorption method and membrane weighing method are used to collect the liquid absorption haze and total suspended particles haze (TSP), respectively. The change of fluorescence parameters (Y(Ⅱ), NPQ, qP, ETR,Fv/Fm) of single algae under the stress of the haze absorption liquid and the total suspended particulate matter are detected by water fluorescence detector. The results show thatChlorellapyrenoidosais more sensitive to exogenous haze exposure, and the fluorescence parameters decreases significantly, especially that the concentration of NPQ decreases by 46.3% and 40.2% under the influence of haze absorption in the two days of heavy pollution, whileMicrocystisaeruginosadisplays obvious characterization only in the interference of total suspended particulate matter leaching solution. Therefore, it is possible that the NPQ parameter ofChlorellapyrenoidosais selected as an indicator for haze biological toxicity.

environmental toxicology; biological toxicity; algae fluorescence; haze;Chlorellapyrenoidosa;Microcystisaeruginosa

1008-1542(2017)03-0305-08

10.7535/hbkd.2017yx03014

2016-11-02；

2017-01-02；責任編輯：王海云

國家863計劃項目(2007AA092201)

崔建升(1966—)，男，河北滄州人，教授，博士，主要從事環(huán)境監(jiān)測技術方面的研究。

E-mail：cui1603@163.com

X835

A

崔建升，趙德華，段莉麗，等.利用藻類熒光檢測霧霾的生物毒性研究[J].河北科技大學學報,2017,38(3):305-312. CUI Jiansheng, ZHAO Dehua, DUAN Lili, et al.Detection of biological toxicity of haze with algae fluorescence[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(3):305-312.