段翠翠，趙玉娟，高磊，牛春華，王春玲，李盛鈺

（吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究所，長春130033）

利用細胞模型和動物模型篩選抗過敏菌株

段翠翠，趙玉娟，高磊，牛春華，王春玲，李盛鈺

（吉林省農業(yè)科學院農產品加工研究所，長春130033）

食物過敏是機體對食物中的主要過敏原產生不正常免疫應答而導致的一種變態(tài)反應。相關研究表明食物過敏主要是由Th1/Th2細胞失衡所致，提示糾正Th1/Th2失衡可緩解食物過敏。近年來，利用益生菌特有的抗過敏作用緩解食物過敏是治療食物過敏的新方向。但缺少篩選用于治療或預防過敏反應的益生菌的方法，本研究利用細胞模型和動物模型篩選具有提高IFN-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平的乳酸菌，可快速準確地篩選到具有抗過敏功能的菌株。

植物乳桿菌；抗過敏；動物模型；Th1/Th2平衡

0 引言

食物過敏是機體對食物中的過敏原產生不正常免疫應答所引發(fā)的一種變態(tài)反應，可造成過敏性鼻炎、哮喘、腹瀉等疾病[1]。益生菌是對宿主健康發(fā)揮有益作用的活的微生物，在過敏機體中補充益生菌可緩解過敏反應[2]。研究者發(fā)現乳酸桿菌具有重要的免疫調節(jié)作用，可調節(jié)免疫細胞分泌不同細胞因子來影響免疫反應，提示具有抗過敏潛力[3-4]。乳酸桿菌可抑制致敏小鼠體內總IgE和抗原特異性IgE的產生，增強IL-12和IFN-γ的分泌而抑制IL-4的產生，進而調節(jié)Th1/Th2平衡[5-7]。

本研究利用細胞模型和動物模型篩選具有提高IFN-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平的乳酸桿菌，并通過動物實驗驗證所篩選菌株的抗過敏效果。該方法簡單可行、實驗周期短、可信度非常高，可為科研工作者節(jié)約大量時間。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4～6周齡雌性清潔級Balb/c小鼠，體重16～18 g，購自長春生物制品研究所有限責任公司，動物合格證號：SCXK（吉）2011-0007，飼養(yǎng)于室溫22℃，光照14 h（06:00-20:00），黑暗10 h條件下，自由采食和飲水。

1.1.2 菌株

28株植物乳桿菌分離自東北酸菜和內蒙古發(fā)酵乳制品，由吉林省農業(yè)科學院農產品加工所乳品加工實驗室保存。

1.1.3 主要化學試劑

卵白蛋白（Ovalbumin，OVA），弗氏完全佐劑，RPMI-1640培養(yǎng)液，青鏈霉素，胎牛血清，紅細胞裂解液，總IgE試劑盒，IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒。

1.1.4 儀器設備

Model 680酶標儀，MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，BCN-1360B超凈工作臺，HZQ-Q電熱恒溫培養(yǎng)箱，胎牛血清，梅特勒-托利多Delta320 pH計，移液槍。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及菌懸液的制備

將28株植物乳桿菌（耐酸耐膽鹽）的凍干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)至穩(wěn)定期，3 000 r/min離心10 min收集菌體。無菌PBS重懸，平板計數測定菌數，將菌懸液濃度調整至約1×109mL-1備用。

1.2.2 脾細胞的分離培養(yǎng)

將小鼠脫頸處死，于70%酒精中浸泡5 min對小鼠進行表面殺菌，無菌條件下取脾臟，放入裝有RP?MI-1640完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清+1%青鏈霉素）的平皿中，用1 mL注射器反復沖洗脾臟，直至脾臟由暗紅色變?yōu)闇\紅色。棄脾，收集脾細胞，離心去上清，加入紅細胞裂解液裂解1 min，RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌3次，獲得脾細胞，調整細胞濃度為5×106mL-1備用。

1.2.3 植物乳桿菌刺激脾細胞分泌細胞因子的測定

將脾細胞與植物乳桿菌按照1∶1共培養(yǎng)，加入刺激物OVA(Ovalbumin)，終質量濃度為1 mg/mL。72 h后離心收集細胞上清，利用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。

1.2.4 建立動物模型

將6～8周齡雌性Balb/c小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，然后隨機分為4組（每組8只），分別為空白組、致敏組、預防組和治療組。致敏組腹腔注射0.2 mL質量濃度為1 mg/mL混勻的過敏原（1 mL弗氏佐劑+1 mL質量濃度1 mg/mL OVA），每周1次，共3次注射，第3次注射6 h后處死。為了判斷是否成功建立動物模型，我們觀察了致敏癥狀，每周尾靜脈采血檢測IgE水平。預防組小鼠灌胃0.1 mL 1×109mL-1的菌液，每周3次，持續(xù)3周，并在第7、14、21 d腹腔注射1 mg/mL混勻的過敏原；治療組在小鼠最后一次致敏后，以0.1 mL灌胃1×109mL-1的菌液，共灌胃9 d；空白組則灌胃0.1 mL的生理鹽水，每周3次，持續(xù)兩周。建模結束后處死小鼠，分離脾臟，提取脾細胞，采用眼球取血，分離血清-80℃保存，待檢測各項指標。

1.2.5 腸道通透性的檢測

第二周皮下注射后，致敏組小鼠中取2只尾靜脈注射1mL芝加哥藍(1%)，10 min后脫頸處死小鼠，截取同部位等質量的小腸，置于500 μL甲酰胺中，5 d后使用分光光度計測量620 mn處的吸光值，即代表小鼠的腸壁血管通透性，治療組和預防組在實驗結束后，以同樣方式處理，檢測灌胃植物乳桿菌后腸壁血管的通透性。

1.2.6 ELISA法檢測脾細胞上清中細胞因子水平

無菌取小鼠脾細胞，調細胞密度為2×106mL-1分別接種于6孔板中，同時加入OVA和植物乳桿菌與脾細胞共培養(yǎng)，37℃質量分數為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h，離心收集上清用于檢測IL-4和IFN-γ的水平。

1.2.7 ELISA法檢測血清中細胞因子水平

建模結束后，摘眼球取血，37℃恒溫箱中靜置1 h，然后4℃條件下，轉速為3 000 r/min離心10 min，取上清，放置于-80℃冰箱中保存，采用ELISA法檢測小鼠血清中細胞因子IL-4和IFN-γ的水平。

1.2.8 ELISA法檢測血清總IgE水平

建模結束后，摘眼球取血，37℃恒溫箱中靜置1 h，然后4℃條件下，轉速為3 000 r/min離心10 min，取上清，放置于-80℃冰箱中保存，按試劑盒說明書測定血清總lgE的水平。450 nm處讀取OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗結果均以平均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05認為差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 植物乳桿菌對小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響

28株植物乳桿菌分別與小鼠脾細胞體外共培養(yǎng)，加入OVA刺激，采用ELISA法檢測脾細胞上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，屬于Th1型細胞因子，機體發(fā)生過敏反應時，IFN-γ促進Th細胞向Th1分化從而對I型超敏反應起到抑制作用，由于菌株對脾細胞產生相應細胞因子的水平差異較大，選擇可刺激脾細胞分泌

IFN-γ水平為主要因素，體外實驗初步篩選獲得SnT、Sc52、Sc9和CH4，這4株菌能夠刺激脾細胞分泌較高水平的IFN-γ，所以我們選擇這4株菌作為具有免疫調節(jié)潛力的益生菌株進行下一步實驗。

表1 植物乳桿菌對小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響pg/mL

2.2 成功建立食物過敏動物模型的判定方法

為了利用體內實驗驗證體外所篩選菌株的抗過敏功能，以OVA為致敏原，利用Balb/c小鼠建立食物過敏動物模型。第一次腹腔注射OVA致敏后，觀察小鼠免疫狀態(tài)，發(fā)現致敏組小鼠出現抓耳、撓腮、活力降低、呼吸困難，毛發(fā)豎起的反應。建模過程中小鼠體重比空白組明顯下降，出現此現象可能是因腹腔注射OVA致敏所致，小鼠對OVA致敏反應強烈，導致體重下降。此外，建模結束處死小鼠后，摘取脾臟，發(fā)現致敏組與空白組相比免疫器官脾臟出現肥大現象。每周尾靜脈采血，檢測血清中的IgE水平，在末次激發(fā)后，IgE水平達到最高，是成功建立食物過敏模型的典型標志（圖1）。

圖1 不同處理時間血清中的IgE水平

2.3 植物乳桿菌對致敏小鼠腸壁血管通透性的影響

受到抗原刺激后，小鼠發(fā)生過敏反應，腸壁血管通透性會發(fā)生變化，如圖2所示。由圖2可以看出，致敏組小鼠腸壁血管通透性最高，但是灌胃4株乳酸菌后，腸壁血管通透性顯著下降，與對照組沒有顯著差異，說明灌胃篩選到的植物乳桿菌后，腸壁血管通透性恢復正常，治療組與預防組結果一致。圖2中，?表示與致敏組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖2 植物乳桿菌對致敏小鼠腸壁血管通透性的影響

2.4 植物乳桿菌對致敏小鼠血清分泌細胞因子的影響

I型過敏性反應的顯著特征是血清中IgE水平的升高，通常被認為是由Th1和Th2型細胞失衡造成的[4]。本研究結果如下表所示，致敏組小鼠血清中IL-4水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）。預防組和治療組結果提示，4株植物乳桿菌均可下調IL-4的分泌水平（P＜0.05），上調IFN-γ的分泌水平（P＜0.05），并且SnT、Sc52和Sc9治療組IFN-γ的分泌水平顯著增加（P＜0.05）。這些結果提示，植物乳桿菌可能通過下調IL-4，上調IFN-γ的水平來影響Th1/ Th2平衡，進而緩解過敏反應，可通過科學調配應用于防治食物過敏癥狀。

表2 植物乳桿菌對致敏小鼠血清分泌Th細胞因子的影響pg/mL

2.5 植物乳桿菌對致敏小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響

Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12等細胞因子，抑制機體產生IgE。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5等細胞因子，促進機體產生IgE。細胞因子間相互刺激，在動態(tài)平衡中調節(jié)機體的細胞免疫。實驗結束后，取各組小鼠脾細胞進行體外共培養(yǎng)實驗，結果如表3所示。與致敏組相比，四株植物乳桿菌均可抑制致敏小鼠脾細胞分泌IL-4，其中SnT和Sc52顯著抑制IL-4分泌水平的增加，而植物乳桿菌Sc9下調IL-4的作用最顯著，接近對照組，植物乳桿菌CH4組IL-4水平低于致敏組，但是差異不顯著。此外，我們檢測了植物乳桿菌對致敏小鼠脾細胞分泌IFN-γ的影響，結果表明，灌胃植物乳桿菌SnT、Sc52和Sc9后，小鼠脾細胞分泌IFN-γ的水平顯著增加，而灌胃植物乳桿菌CH4后，雖然IFN-γ的分泌水平與致敏組相比顯著增加，但是顯著低于空白組。

2.6 植物乳桿菌對小鼠血清總IgE水平的影響

實驗結束后，摘眼球取血，利用ELISA方法檢測各實驗組中血清中總IgE水平的變化，如圖3所示。結果表明，致敏小鼠血清總IgE含量顯著高于空白組（P＜0.05），灌胃各種乳酸菌的預防組和治療組小鼠血清中的總IgE水平均顯著低于致敏組（P＜0.05）。通過結果可知，SnT、Sc52、Sc79和CH4均有效抑制總IgE水平（P＜0.05），進而緩解食物過敏。圖3中，?表示與致敏組相比差異顯著（P＜0.05）。

表3 植物乳桿菌對致敏小鼠脾細胞分泌Th細胞因子的影響pg/mL

圖3 植物乳桿菌對小鼠血清總IgE水平的影響

3 討論

大量研究證實某些乳酸菌具有抗過敏功能，表現為刺激免疫細胞分泌某種細胞因子來發(fā)揮抗過敏作用[8-9]。因此，可以利用這一特點來篩選具有抗過敏潛力的乳酸菌。食物過敏的顯著特征是IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，即存在Th1/Th2細胞失衡，本研究首先利用體外細胞實驗從耐酸、耐膽鹽菌株中篩選能夠刺激免疫細胞分泌高水平IFN-γ的菌株，然后以OVA為致敏原，Balb/c小鼠為實驗動物建立致敏動物模型，灌胃篩選到的具有抗過敏潛力的乳酸菌，利用動物模型進一步驗證所篩選菌株的抗過敏能力。

在體外細胞實驗中，我們分離培養(yǎng)脾細胞，將28株乳酸菌與脾細胞共培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子水平。我們篩選到了四株具有抗過敏潛力的乳酸菌，分別為SnT，Sc52，Sc79和CH4，這4株菌可以刺激脾細胞產生較高水平的IFN-γ，提示其可能通過上調機體中IFN-γ水平來緩解過敏反應，但是體外實驗并不能完全證實此益生功能，我們需要進一步實驗進行驗證。

以Balb/c小鼠為實驗動物，腹腔注射致敏原OVA，建立食物致敏模型，灌胃植物乳桿菌后，致敏癥狀減輕，不再表現出抓耳、撓腮、活力降低和呼吸困難等癥狀。實驗結束后我們檢測了脾細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子水平，結果證實4株乳酸菌可以上調致敏小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平，下調IL-4的水平，提示乳酸菌可通過糾正過敏機體中的Th1/Th2平衡來緩解食物過敏，血清檢測結果也證實了這一推斷。

IgE在食物過敏反應中起重要作用。當初次接觸過敏原后刺激機體產生IgE，IgE在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面結合使機體呈致敏狀態(tài)。研究表明，在益生菌干預下可有效降低IgE的產生[4,6,10]。因此我們檢測了各組小鼠血清中的IgE水平，灌胃植物乳桿菌4株乳酸菌后，小鼠血清中IgE水平顯著降低，提示這4株乳酸菌可通過降低體內IgE水平緩解食物過敏反應。從免疫學角度來說，IgE水平降低往往伴隨IFN-γ水平升高，即IFN-γ可調控IgE的產生。這與我們的實驗結果一致。

本研究利用體外細胞實驗篩選到具有抗過敏潛力的乳酸菌，并利用動物模型驗證了4株乳酸菌的抗過敏能力，成功獲得具有抗過敏功能的乳酸菌。該方法實驗周期短，投入成本低，如果將過敏原換成β-乳球蛋白就可以建立牛乳過敏模型，因此這是一種可以推廣使用的用于篩選抗過敏菌株的有效方法。

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Screening of Lactic acid bacteria(LAB)characterized by antianaphylaxis using cell and animal models

DUAN Cuicui,ZHAO Yujuan,GAO Lei,NIU Chunhua,WANG Chunling,LI Shengyu
(Institute of Agri-food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China)

Food allergy is an allergic reaction caused by abnormal immune response by human body to the main allergens in food.Related studies have shown that food allergies are mainly caused by Th1/Th2 imbalance,indicating that shifting Th1/Th2 imbalance can alleviate food allergies.In recent years,it is a new direction for the treatment of food allergy to use probiotic-specific anti-allergic effects.However,it is lack of screening method to obtain probiotics for the treatment or prevention of allergic reaction.This study used cell and animal models to screen anti-allergyLactic acid bacteriathat could up-regulate IFN-γ secretion level and down-regulate IL-4 secretion level so as to quickly and accurately obtain the target strains.

Lactobacillus plantarum;antianaphylaxis;animal model;Th1/Th2 balance

Q93-331

A

1001-2230（2017）05-0010-04

2016-10-24

國家現代農業(yè)（奶牛）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-37）；中國博士后科學基金面上資助項目（2016M591500）；吉林省農業(yè)科學院博士后科研啟動基金項目（c5282010318）。

段翠翠（1984-），女，博士研究生，研究方向為乳品加工。

李盛鈺