徐大琴，席進(jìn)孝，王鼎盛，郭麗民，吳 斌，蓋永志，穆洮霞

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喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地牧羊犬耶爾森菌感染和攜帶狀況初步調(diào)查

徐大琴，席進(jìn)孝，王鼎盛，郭麗民，吳 斌，蓋永志，穆洮霞

目的 了解喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地牧羊犬耶爾森菌感染和攜帶狀況，探討3種致病性耶爾森菌在自然界是否存在替代或拮抗關(guān)系，為鼠疫防控提供新方法。方法 采集喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地牧羊犬血清、肛拭子標(biāo)本進(jìn)行致病性耶爾森菌的檢測(cè)與分析。結(jié)果 檢測(cè)阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天?？h牧羊犬血清分別為88、94、70、64份，陽性率分別為31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)。采集阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天?？h的牧羊犬肛拭子共171份進(jìn)行致病性耶爾森菌分離，動(dòng)物間鼠疫流行猛烈的阿克塞、肅北分別分離出1株克氏耶爾森菌和2株非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。結(jié)論 喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地動(dòng)物間鼠疫流行猛烈地區(qū)的牧羊犬感染和攜帶非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

旱獺鼠疫自然疫源地；牧羊犬；耶爾森菌；調(diào)查分析

耶爾森菌屬屬于腸桿菌科，包括18個(gè)菌種，其中對(duì)人和動(dòng)物具有致病性的有3種:鼠疫耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌。有研究表明這3種致病性耶爾森菌具有共同位于毒力質(zhì)粒上的V抗原，感染其中某一種致病性耶爾森菌后，機(jī)體就會(huì)獲得保護(hù)性免疫，不會(huì)再感染其他種致病性耶爾森菌[1]。如在我國(guó)甘寧黃土高原鼠疫疫源地家鼠和農(nóng)家周邊的野鼠體內(nèi)檢測(cè)不出鼠疫耶爾森菌，但小腸結(jié)腸炎耶爾森菌攜帶率卻很高，而在內(nèi)蒙古高原鼠疫疫源地中家、野鼠小腸結(jié)腸炎和假結(jié)核攜帶率很低，但卻有鼠疫的發(fā)生和流行[2]。牧羊犬不僅是鼠疫的指示動(dòng)物，而且也是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要儲(chǔ)存宿主和主要傳染源[3-5]，本文通過初步調(diào)查喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地牧羊犬耶爾森菌感染和攜帶狀況，能夠?yàn)樘接懜拭C省鼠疫耶爾森菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌之間的關(guān)系提供初步依據(jù)，為甘肅鼠疫防控提供新思路。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源：2013-2015年采集阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天祝縣牧羊犬血清分別為88、94、70、64份(見表2)，肛拭子標(biāo)本分別為50、45、73、68份。

1.2 菌株分離及鑒定 參考文獻(xiàn)[6]方法采集和處理牧羊犬血清，并檢測(cè)血清中鼠疫F1抗體。試劑配制及操作按說明書進(jìn)行，判定標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)WS 279-2008》。采集的牧羊犬肛拭子標(biāo)本，參考文獻(xiàn)[7]方法將標(biāo)本置于PBS培養(yǎng)基中，4 ℃ 20 d后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Tiangen, china)提取樣本核酸，進(jìn)行foxA，ail，inv基因的擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)[8]方法將foxA，ail，inv基因陽性標(biāo)本接種于選擇性平板(CIN agar,Difco)，進(jìn)行分離培養(yǎng),并采用Api20E腸桿菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的血清分型，生物分型鑒定參考文獻(xiàn)[8-9]方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離株毒力基因ail、ystA、ystB、yadA、virF、rfbC以確定菌株的致病性。各種毒力基因特異性引物系列及擴(kuò)增條件見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件
Tab.1 Primer sequences and amplification conditions

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence產(chǎn)物大小Size/bp退火溫度Annealingtemperature/℃ailForwardTAATGTGTACGCTGCGAG35157ReverseGACGTCTTACTTGCACTGystAForwardATCGACACCAATAACCGCTGAG7961ReverseCCAATCACTACTGACTTCGGCTystBForwardGTACATTAGGCCAAGAGACG14661ReverseGCAACATACCTCACAACACCyadAForwardCTTCAGATACTGGTGTCGCTGT84960ReverseATGCCTGACTAGAGCGATATCCvirFForwardGGCAGAACAGCAGTCAGACATA56163ReverseGCTGAGCATAGAGAATACGTCGrfbCForwardCGCATCTGGGACACTAATTCG40555ReverseCCACGAATTCCATCAAAACCACC

1.3 主要試劑和儀器 改良磷酸鹽緩沖液(PBS)(購(gòu)自Fluka, peptone sorbitol bile broth),腦心浸液培養(yǎng)基(購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基(購(gòu)自O(shè)XOID,Yersiniaselective agar base)Api20E生化鑒定條(購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司 bioMérieux)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)(購(gòu)自天根生化北京有限公司)，PCR擴(kuò)增用Premix Tap酶(Version 2.0 plus dye)、2000 bpDNA Ladder(DL2000)購(gòu)自TaKaRa公司。瓊脂糖為BioWest公司，分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社。生物安全柜(SG403INT型、The Baker Company)、PCR儀為德國(guó)senso梯度PCR儀LabCycler Standard plus型，臺(tái)式高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司Eppendorf centrifuge5415D，電泳儀(DYY-C6型，北京六一儀器廠)，凝膠成像儀為美國(guó)伯樂(Bio-Rad公司)GEL Doc2000。間接血凝試劑由吉林博德醫(yī)學(xué)免疫制品有限公司提供(No.20130101)。

2 結(jié) 果

2.1 牧羊犬血清F1抗體 從2013年至2015年，我們?cè)谙柴R拉雅旱獺鼠疫自然疫源地阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天?？h分別采集了88、94、70、64份牧羊犬血清，陽性率分別達(dá)到了31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)，其中2015年阿克塞、肅北牧羊犬血清血凝最高抗體滴度均達(dá)到1∶1 280，提示本地區(qū)動(dòng)物間鼠疫流行猛烈(按鼠疫自然疫源地及動(dòng)物鼠疫流行判斷標(biāo)準(zhǔn)，GB 16883-1997)。肅南和天祝只有2013年檢出有陽性血清，最高抗體滴度為1∶128，尚未達(dá)到判定動(dòng)物間鼠疫流行猛烈標(biāo)準(zhǔn)。

表2 2013年-2015年牧羊犬血清F1抗體檢驗(yàn)結(jié)果
Tab.2 Serum F1 antibody test results of shepherd dog from 2013 to 2015

年份Year陽性率(%)Positiverate阿克塞Akesai肅北Subei肅南Sunan天祝Tianzhu201325(5/20)55.88(19/34)6.67(2/30)5(1/20)201412.90(4/31)16.67(5/30)0(0/20)0(0/23)201551.35(19/37)23.33(7/30)0(0/20)0(0/21)Total31.82(28/88)32.98(31/94)2.86(2/70)1.56(1/64)

2.2 分離菌株及菌株生化鑒定、分型及毒力檢測(cè) 采集甘肅省鼠疫自然疫源地阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天祝縣地區(qū)牧羊犬肛拭子標(biāo)本分別為57、64、30、20份進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分離，結(jié)果分離出2株小腸小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，1株克氏耶爾森菌，分離率分別為2%(1/50)、4.44%(2/45)、0%(0/30)、0%(0/20)，見表3。對(duì)分離到的菌株進(jìn)行API 20E生化鑒定條鑒定，2株生物型均為1A型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,其毒力基因特征為ail-ystA-ystB-yadA-virF-rfbc-和ail-ystA-ystB+yadA-virF-rfbc-[8-9]，1株為克氏耶爾森菌。

表3 菌株分離情況
Tab.3 Strains of isolation

分離地點(diǎn)Location分離率(%)Separationrate生化鑒定結(jié)果Biochemicalidentificationresults小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Yersiniaenterocolitica克氏耶爾森菌Yersiniakristensenii阿克塞Akesai2(1/50)-1肅 北Subei4.44(2/45)2-肅 南Sunan0(0/30)--天 祝Tianzhu0(0/20)--

注：“-”代表未分離出菌株

Note: "-" represents not isolated strains

3 討 論

牧羊犬是喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地牧民必不可少的好助手，它在牧場(chǎng)主要負(fù)責(zé)警衛(wèi)，如避免牛、羊、馬等逃走或遺失、保護(hù)家畜免于熊或狼的侵襲，杜絕偷盜行為等，因其活動(dòng)范圍廣，又有叼食嚙齒動(dòng)物或尸體和搜尋嗅獵洞穴的習(xí)慣，染疫風(fēng)險(xiǎn)高，放牧人主要通過與其密切接觸感染、發(fā)病[3-10]，牧羊犬也是鼠疫的一種高抗動(dòng)物[11]，通過檢測(cè)犬體內(nèi)鼠疫F1抗體，可以預(yù)測(cè)和預(yù)警鼠疫的發(fā)生、發(fā)展過程、流行強(qiáng)度和范圍，因此，我國(guó)把檢測(cè)牧羊犬血清F1抗體列入了鼠疫監(jiān)測(cè)方案。本次調(diào)查來自阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天祝縣采集的牧羊犬血清，陽性率分別達(dá)到了31.82%(28/88)、32.98%(31/94)、2.86%(2/70)、1.56%(1/64)，其中阿克塞、肅北牧羊犬血清血凝最高抗體滴度均達(dá)到1∶1 280，而肅南縣、天祝縣牧羊犬血清血凝最高抗體滴度均只達(dá)到1∶128，結(jié)果提示阿克塞縣、肅北縣兩地區(qū)動(dòng)物間鼠疫流行猛烈。這與阿克塞縣、肅北縣鼠疫監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示一致：即阿克塞縣最近一次人間鼠疫發(fā)生在2010年，動(dòng)物間疫情流行呈逐年上升趨勢(shì)，尤其從活體旱獺及媒介昆蟲檢出多株鼠疫菌，疫情呈多點(diǎn)爆發(fā)流行態(tài)勢(shì)；肅北縣近年來動(dòng)物間鼠疫流行連綿不斷呈上升趨勢(shì)，在旱獺剛出蟄就有大量旱獺死亡，檢菌地點(diǎn)范圍有所增加，疫情呈多點(diǎn)爆發(fā)流行，并分別于2007年、2014年各發(fā)生2次4起人間鼠疫。

有學(xué)者認(rèn)為由于3種致病性耶爾森菌具有共同位于毒力質(zhì)粒上的的V抗原，感染某一種致病性耶爾森菌后會(huì)獲得保護(hù)性免疫，當(dāng)再次暴露在其他種致病性耶爾森菌污染的環(huán)境中不會(huì)發(fā)生感染[1]。牧羊犬不僅是鼠疫的高抗動(dòng)物[11]，同時(shí)也是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的主要儲(chǔ)存宿主和主要傳染源[3-5]，研究表明[12]小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在中國(guó)分布廣泛，云南、寧夏、青海等省份均從鼠疫耶爾森菌的疫源地分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[13-14]。因此，我們采集喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地牧羊犬肛拭子，進(jìn)行牧羊犬耶爾森菌感染和攜帶狀況的調(diào)查。本次調(diào)查分別采集自喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地阿克塞縣、肅北縣、肅南縣、天?？h4個(gè)縣牧羊犬肛拭子共171份進(jìn)行耶爾森菌的分離。阿克塞縣共采集57份牧羊犬肛拭子，分離出1株克氏耶爾森菌。肅北共采集64份牧羊犬肛拭子，分離出2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，生物型均為1A型。但是，從這3份分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的牧羊犬采集的血清鼠疫F1抗體結(jié)果卻是陰性，且未能從阿克塞28份、肅北31份牧羊犬血清鼠疫F1抗體結(jié)果是陽性的肛拭子標(biāo)本中分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。是否因牧羊犬?dāng)y帶了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌而阻止了鼠疫耶爾森菌的感染，或攜帶了鼠疫耶爾森菌而阻止了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的感染，我們將對(duì)該疫源地的主要宿主動(dòng)物旱獺攜帶耶爾森菌情況做進(jìn)一步的研究。自肅南縣采集牧羊犬肛拭子73份，卻未分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及假結(jié)核耶爾森菌。肅南縣1961年首次在康樂鄉(xiāng)楊哥村扎科旱獺體內(nèi)檢出鼠疫菌后，被確定為喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，近10年發(fā)生動(dòng)物疫情15起，未發(fā)生人間鼠疫疫情，屬現(xiàn)疫鼠疫疫源縣。雖然該疫源地動(dòng)物間鼠疫疫情流行弱，發(fā)生人間鼠疫的風(fēng)險(xiǎn)較阿克塞、肅北低，但肅南縣疫源面積大，分布廣，隨著旅游業(yè)、礦業(yè)、水能資源的開發(fā)，疫區(qū)人員流動(dòng)頻率增加，人員復(fù)雜，也為我們鼠疫防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)，因此，我們將對(duì)該疫源地進(jìn)行進(jìn)一步的研究。祁連山東段的天?？h共68份牧羊犬肛拭子，卻未分離出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及假結(jié)核耶爾森菌。天?？h自1963年從一只旱獺體內(nèi)分離出鼠疫菌，在此后的50多年間既未檢出鼠疫菌，也沒有發(fā)現(xiàn)具有流行病學(xué)意義的抗體滴度，雖然2013年牧羊犬檢出1個(gè)血清陽性，抗體滴度達(dá)到了1∶128，但是尚不能說明該疫源地動(dòng)物間鼠疫流行。

是否因?yàn)檫@次采集的牧羊血清樣本量小，不足以得出3種致病性耶氏菌在自然界是否存在替代或拮抗關(guān)系的結(jié)論。我們將對(duì)該疫源地進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過本次調(diào)查研究，我們共分離到2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和1株克氏耶爾森菌，均為不致病性小腸耶爾森菌。究竟甘肅鼠疫疫源地內(nèi)主要宿主攜帶的3種致病性耶爾森菌關(guān)系如何,我們?nèi)孕枳鲞M(jìn)一步的研究。

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Yersiniainfection and carrier in shepherd dog on the natural foci ofMarmotahimalayanaplague

XU Da-qin, XI Jin-xiao, WANG Ding-sheng, GUO Li-min, WU Bin, GAI Yong-zhi, MU Tao-xia

(GansuProvincialCentreforDiseaseControlandPrevention,Lanzhou730000,China)

We studiedYersiniainfection and carriage in shepherd dog on the natural foci ofMarmotahimalayanaplague and investigated the substitution or antagonism relationship among three pathogenicYersiniain nature, providing a novel approach for prevention and control of plague. Blood sample and rectal swab specimens from shepherd dogs were collected. Rectal swab specimens were detected and isolated forY.enterocoliticanandY.pseudotuberculosis. IHA was used to measure the positive rate of F1 antibody. Results showed that among 88, 94, 70 and 64 serum specimens respectively from Akesai, Subei, Sunan, and Tianzhu, IHA positive rates were 31.82%, 32.98%, 2.86% and 1.56% separately. A total of 236 anal swab specimens of shepherd dog were collected, among which oneY.kristenseniistrain and 2 non-pathogenicY.enterocoliticastrain were recovered from Akesai and Subei respectively, where plague was violently prevalent in animals. All the results indicate that shepherd dogs in natural foci ofM.himalayanaplague where plague in animals are prevalent with non-pathogenicY.enterocolitica, is an evidence of antagonism relationship in three pathogenicYersinia.

natural foci ofMarmota; himalayana plague; shepherd dog;Yersinia; investigation and analysis

Xi Jin-xiao, Email: xijxxp@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.008

國(guó)家自然科學(xué)基金((No.81560541)資助

席進(jìn)孝，Email:xijxxp@163.com

甘肅省疾病預(yù)防控制中心，蘭州 730000

R378

A

1002-2694(2017)06-0513-04

2016-11-03 編輯：梁小潔

Supported by the National Science Foundation of China (No. 81560541)