張 波，張蓓蓓，程曉丹，華 慧，于 倩，顏 超，湯仁仙，鄭葵陽

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華支睪吸蟲成蟲抗原和排泄分泌產(chǎn)物對T細(xì)胞的作用研究

張 波，張蓓蓓，程曉丹，華 慧，于 倩，顏 超，湯仁仙，鄭葵陽

目的 觀察華支睪吸蟲成蟲抗原(Crude antigen，CA)、排泄/分泌產(chǎn)物(excretory-secretory products，ESPs)對T細(xì)胞的作用。方法 體外分離小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化為未成熟骨髓樹突狀細(xì)胞(immature DC，iDC)；磁珠分選儀分選小鼠脾臟細(xì)胞的初始CD4+T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)檢測DC、CD4+T細(xì)胞的純度；抗原刺激DC細(xì)胞，實驗分為PBS陰性對照組，LPS陽性對照組，CA和ESPs刺激組；負(fù)載抗原后的DC細(xì)胞與分選的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)72 h；Real time-PCR檢測T-bet、GATA3 mRNA的相對表達量；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4細(xì)胞因子的表達量。結(jié)果 與PBS組相比，ESPs刺激組T-bet、GATA3 mRNA表達水平升高(P<0.05)，而CA刺激組T-bet、GATA3 mRNA表達水平差異不顯著；與PBS組相比，ESPs刺激組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的含量均升高(P<0.05)，CA刺激組僅IFN-γ的分泌增高(P<0.05)，IL-4無明顯變化。結(jié)論 CA可能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，ESPs可能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th1型、Th2型免疫應(yīng)答。

華支睪吸蟲；DC細(xì)胞；CD4+細(xì)胞；成蟲抗原；排泄/分泌產(chǎn)物

Funded by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81171590, 81572019),the Chinese Academy of Agricultural Sciences (Grant No. SKLVEB2013KFKT005), a Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD). Corresponding author: Zheng Kui-yang,Email: zky02@163.com

華支睪吸蟲病是一種因人或犬貓等哺乳動物食入含有華支睪吸蟲囊蚴的淡水魚而感染的食源性寄生蟲病，中國，韓國，越南等是本病嚴(yán)重的國家[1-5]。

特異性抗原刺激后，在不同的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的作用下CD4+T細(xì)胞增殖分化形成不同的細(xì)胞亞群，包括Th1，Th2等細(xì)胞亞群[6]。Th1、Th2兩細(xì)胞亞群分別在細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，其中Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗細(xì)胞內(nèi)病原體如利仕曼原蟲、結(jié)核桿菌感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而Th2類免疫應(yīng)答在抗細(xì)胞外病原體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用，如Th2細(xì)胞能夠緩解腸道蠕蟲如巴西日圓線蟲的感染[7-8]。病原體-抗原提呈細(xì)胞(APCs)的相互作用是引發(fā)機體Th1/Th2免疫應(yīng)答的始動因素，樹突狀細(xì)胞(DC)作為功能最強大的抗原遞呈細(xì)胞，其識別的抗原遞呈給CD4+T細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)其活化，增殖，分化，并決定其所分泌細(xì)胞因子的類型及劑量[9]。在宿主本身內(nèi)環(huán)境因素或外來不同抗原的刺激下，寄生蟲感染中DC影響機體對寄生蟲感染形成不同的免疫應(yīng)答狀態(tài)[10]。關(guān)于華支睪吸蟲特異性抗原體外被DC特異性識別及將信號遞呈給初始CD4+T細(xì)胞，是如何調(diào)控Th1、Th2細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，目前仍未闡明。本研究在細(xì)胞水平闡明華支睪吸蟲源性抗原對Th1、Th2細(xì)胞的極化作用，為深入研究華支睪吸蟲的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 健康雌性6～8周齡BALB/c小鼠，購買自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)。CD4+T細(xì)胞磁珠抗體(德國MiltenyiBiotec公司)；流式抗體CD11c(FITC)、CD4(PerCP-Cy5-5)(美國eBioscience公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；IL-4、GM-CSF細(xì)胞因子(美國PEPROTECH公司)；IFN-γ、IL-4 ELISA檢測試劑盒(美國eBioscience公司)；總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，(北京天根生化科技有限公司)；SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備：CA的制備參照文獻[11]。ESPs制備參照文獻[12]。

1.2.2 骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)分離培養(yǎng)和純度檢測：取BALB/c小鼠股骨及脛骨，浸泡于75%乙醇10 min，剪刀去除肌肉組織后，使用1 mL注射器將骨髓腔中細(xì)胞沖凈，裂解紅細(xì)胞，常規(guī)1 500 r/min洗滌5 min，重復(fù)兩遍。細(xì)胞計數(shù)后，用含有IL-4和GM-CSF(終濃度10 ng/mL)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后全量換液，4 d后半量換液，第6 d收集細(xì)胞，取約1×105個細(xì)胞加入1 μL CD11c抗體室溫孵育15 min，洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測其純度。

1.2.3 CD4+T細(xì)胞的分離及純度檢測：取BALB/c小鼠脾臟，包裹于200目濾膜中研磨棒研碎，裂解紅細(xì)胞，常規(guī)洗滌之后，細(xì)胞計數(shù)，每1×107個細(xì)胞加入10 μL CD4+T細(xì)胞磁珠抗體，4 ℃孵育15 min。常規(guī)洗滌，全自動磁珠分選儀分選細(xì)胞，取出CD4+陽性細(xì)胞管，洗滌之后加入1 μL CD4流式抗體，室溫孵育15 min，洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測其純度。

1.2.4 抗原刺激DC細(xì)胞：收集誘導(dǎo)6 d后的細(xì)胞，PBS洗滌3次，用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為1×106/mL，按1 mL/孔分別加入24孔板中，并加相應(yīng)致敏原，刺激24 h。實驗分組如下：LPS(LPS 1 μg/mL)；PBS組；CA組(CA 80 μg/mL)；ESPs組(ESPs 50 μg/mL)。

1.2.5 DC細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)：將2.5×105個負(fù)載抗原的DC細(xì)胞與1.25×106個CD4+T細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，共培養(yǎng)72 h。離心分別收集細(xì)胞和上清備用。

1.2.6 Realtime-PCR檢測T-bet、GATA3的相對表達量：常規(guī)提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按20 μL Real-time PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×Con(SYBRGreenI Master) 10 μL，上游引物(10 μM) 1 μL，下游引物(10 μM) 1 μL，PCR級用水7 μL，混勻。反應(yīng)程序為pre-incubation 95 ℃ 5 min，擴增循環(huán) 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以β-actin基因為內(nèi)參，校正每個樣本目的基因的Ct值，計算△Ct值，以2-△△Ct值計算基因相對表達水平。

1.2.7 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4的表達量：檢測方法按照試劑盒中的說明進行，每組設(shè)3個復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1 BMDCs、CD4+T細(xì)胞純度檢測 誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠BMDCs培養(yǎng)6 d之后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，低倍鏡下見及大量大小不一的集落，細(xì)胞成簇生長；高倍鏡下細(xì)胞圓形，并有長短不一的突起伸出細(xì)胞表面(見圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度，結(jié)果顯示CD11c+細(xì)胞所占比例在90%以上(見圖2 A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選后的CD4+T細(xì)胞的純度，其純度在90%以上(見圖2 B)。以上結(jié)果表明培養(yǎng)的BMDCs、分選的CD4+T細(xì)胞可用于實驗中。

圖1 小鼠BMDCs誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d顯微鏡下形態(tài)(A：放大40倍，B：放大400倍, →: 集落)Fig.1 Observation of BMDCs by microscope on day 6 (A：×40，B:×400, → : colony)

A、流式細(xì)胞術(shù)檢測BMDCs純度；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+ T細(xì)胞純度A：Purify of BMDCs；B：Purify of CD4+T cells圖2 BMDCs、CD4+ T細(xì)胞純度檢測Fig.2 Purification of BMDCs and CD4+T cells

2.2 CD4+T細(xì)胞T-bet、GATA3 mRNA的表達水平 我們通過Real time PCR檢測了T-bet、GATA3基因表達水平，結(jié)果表明與對照組相比CA、ESPs刺激組T-bet、GATA3基因表達水平均是增高的，但是只有ESPs刺激組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，(圖3)。

注：*：vs PBS 組P<0.05Note：*：vs PBS group, P<0.05圖3 Real-time PCR檢測T-bet、GATA-3 mRNA的相對表達水平Fig.3 Relative expression of T-bet and GATA-3 mRNA

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4、IFN-γ的表達水平 為了檢測Th1型及Th2型細(xì)胞因子的表達水平，采用ELISA法檢測IFN-γ及IL-4細(xì)胞因子的表達情況，實驗結(jié)果表明：與PBS組相比，CA刺激組IFN-γ表達顯著升高(P<0.05)，IL-4的表達無明顯變化；ESPs刺激組IFN-γ、IL-4的表達與PBS組相比均顯著升高(P<0.05)(圖4)。

注：*：vs PBS 組P<0.05；***：vs PBS組P<0.001Note：*：vs PBS group, P<0.05; ***：vs PBS group, P<0.001圖4 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4表達量Fig.4 The levels of IFN-γ and IL-4 cytokines

3 討 論

目前研究結(jié)果顯示，蠕蟲感染過程中CD4+T細(xì)胞亞群的分化對機體抵抗病原體入侵起著重要的作用。如旋毛蟲體內(nèi)的熱休克蛋白70(Heat shock protein 70)可以致敏DC細(xì)胞從而促進CD4+T細(xì)胞分泌大量的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、Th2型細(xì)胞因子IL-4[13]，而肝片吸蟲、血吸蟲感染小鼠隨著感染時間的延長，表現(xiàn)出Th2型優(yōu)勢免疫應(yīng)答，這可能是由于Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10細(xì)胞因子抑制了IFN-γ的分泌，進而抑制Th1細(xì)胞的功能[14-15]。研究表明隨著華支睪吸蟲感染BABL/c小鼠時間的延長，在感染2～4 w后體外培養(yǎng)的脾臟細(xì)胞Th2型細(xì)胞因子IL-10、IL-5分泌增加，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2分泌減少[16]。我們通過磁珠分選的技術(shù)手段將CD4+T細(xì)胞分離純化后分別與CA、ESPs致敏的骨髓DC細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，T-bet、GATA3基因表達水平均是增高的。T-bet、GATA-3分別是初始T細(xì)胞分化成Th1、Th2細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，T-bet不僅控制Th1細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生，同時還能抑制Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌，而IFN-γ又可以促進T-bet的表達。因此二者形成正反饋關(guān)系[17-18]，而Th2細(xì)胞分泌IL-4需要GATA-3基因的表達，且GATA-3與T-bet之間亦有著相互抑制的關(guān)系。ELISA結(jié)果顯示，CA刺激組IFN-γ的分泌顯著升高，IL-4的分泌未見升高，ESPs刺激組IFN-γ、IL-4分泌均升高。

寄生蟲感染不同階段的抗原引起的免疫反應(yīng)也是不一樣的，如血吸蟲可溶性成蟲抗原(SWA)在體外刺激脾臟細(xì)胞后促進Th1型免疫應(yīng)答，蟲卵抗原(SEA)體外則促進Th2型優(yōu)勢免疫應(yīng)答。華支睪吸蟲CA刺激增強DCs的免疫學(xué)活性后，DCs與脾臟總淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生Th1型而不是Th2型免疫應(yīng)答。我們的結(jié)果表明CA可能在Th1型免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，這與之前的實驗結(jié)果一致。ESPs可能在Th1型、Th2型免疫反應(yīng)均發(fā)揮重要的作用。在華支睪吸蟲感染小鼠的研究中顯示，在感染早期表現(xiàn)出Th1型保護性免疫，而隨著感染時間的延長，逐漸向Th2型保護性免疫漂移，所以CA抗原中的一些成分可能在感染早期發(fā)揮作用。而ESPs在華支睪吸蟲感染的整個階段持續(xù)發(fā)揮作用。

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Effects of crude antigen and excretory-secretory products ofClonorchissinensison T cells

ZHANG Bo, ZHANG Bei-bei, CHENG Xiao-dan, HUA Hui, YU Qian, YAN Chao, TANG Reng-xian, ZHENG Kui-yang

(JiangsuKeyLaboratoryofImmunityandMetabolism,DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221004,China)

We investigated the roles of the crude antigen(CA) ofClonorchissinensisand excretory-secretory products (ESPs) in the polarization of Th1 and Th2 cells. Bone marrow-derived cells were generated from BALB/c mice and isolated into immature DCs; immature DCs were then treated with either CA (CA stimulated group), ESPs (ESPs stimulated group), LPS (positive control group) or PBS (negative control group) for 24 hours. Then the CD4+T cells were isolated from mouse spleen by using anti-mouse-CD4 Microbeads, and further cocultured with stimulated DCs for another 72 hours. The purities of DCs and CD4+T cells were evaluated by flow cytometry and the expressing levels of T-bet mRNA and GATA-3 mRNA were detected by real-time PCR. ELISA was used to detect the levels of IFN-γ and IL-4 cytokines in the supernatant. mRNA levels of T-bet and GATA-3 in the ESPs group were higher than those in PBS-stimulated group (P<0.05). The concentrations of IFN-γ and IL-4 cytokines in the culture were increased in the ESPs group, compared with PBS stimulated group(P<0.05). IFN-γ but not IL-4 was increased in CA group (P<0.05). The results implied that CA might play a role in Th1 type immune response, and ESPs likely play roles in both Th1 and Th2 immune responses.

Clonorchissinensis; DCs; CD4+T cells; crude antigen; excretory-secretory products

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.004

國家自然科學(xué)基金(No.81171590，81572019);家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室開放課題(No.SKLVEB2013KFKT005)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)聯(lián)合資助

鄭葵陽，zky02@163.com

江蘇省免疫與代謝重點實驗室，徐州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室/感染與免疫實驗室，徐州 221004

R383

A

1002-2694(2017)06-0491-04

2017-01-12 編輯：李友松