周 航，黃曉玲*，李 攀，尚婷婷，朱蕾蕾，王志剛

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400016)

靶向癌胚抗原載藥納米超聲造影劑體外抑制卵巢癌細胞生長

周 航1，黃曉玲1*，李 攀2，尚婷婷2，朱蕾蕾2，王志剛2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400016)

目的 制備靶向癌胚抗原(CEA)載藥相變型PLGA納米粒(Ab-PTX-NPs)，探討該納米粒的體外尋靶及抑制腫瘤細胞生長的效能。方法 乳化溶劑揮發(fā)法聯(lián)合碳二亞胺法制備靶向CEA載紫杉醇納米粒(Ab-PTX-NPs)，采用馬爾文粒徑分析儀檢測其粒徑大小。采用高效液相色譜法檢測紫杉醇包封率及載藥量，恒溫搖床透析法檢測該納米粒體外釋藥特征。激光共聚焦顯微鏡及流式細胞術(shù)觀察該納米粒體外尋靶情況，CCK-8試劑檢測卵巢癌細胞存活率。結(jié)果 制備的Ab-PTX-NPs粒徑為(397.70±99.95)nm，紫杉醇包封率及載藥量分別為(67.26±4.15)%和(6.31±0.39)%。抗CEA單克隆抗體與納米粒連接率為(92.74±5.75)%。共聚焦顯微鏡下觀察到靶向組卵巢癌SKOV3細胞周圍見較多造影劑黏附，流式細胞術(shù)測得靶向組細胞平均熒光強度明顯高于其余各組(P<0.05)，CCK-8試劑法測得靶向組在24 h時，細胞存活率高于純藥組(P<0.05)，而低于無靶組(P<0.05)，當48 h時，靶向組與純藥組細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 成功制備靶向CEA載藥相變型PLGA納米粒，該納米粒經(jīng)低功率聚焦超聲治療儀(LIFU)致相變后可明顯增強超聲顯影，且載藥量高，釋藥快，靶向能力強。

卵巢腫瘤；超聲檢查；造影劑；紫杉醇；靶向治療

卵巢癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而居第3位，但病死率卻高居第1位[1]。因此，早期準確地診斷與治療，對其預(yù)后至關(guān)重要。隨著超聲分子影像學(xué)的發(fā)展，聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]納米粒以其良好的生物組織相容性和生物安全性，已被用于腫瘤的分子顯像與治療等研究[2-4]。納米粒的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)超聲造影劑粒徑大(2～8 μm[5])，只能用于血池顯影的局限性。同時，將臨床常用的廣譜化療藥物紫杉醇(paclitaxel, PTX)包載入PLGA，制成多功能納米粒，不僅可避免由于藥物疏水性帶來的給藥困難，還可避免有機溶劑引起的過敏反應(yīng)。但提高PLGA多功能納米粒對腫瘤組織靶向超聲造影和治療的效率，一直是研究的難點。本研究擬制備一種靶向癌胚抗原(carcino-embryonic antigenm, CEA)載紫杉醇相變型PLGA納米粒(Ab-PTX-NPs)，探討其對卵巢癌細胞的體外尋靶能力及抑制腫瘤細胞生長情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料和試劑 聚乳酸-乙醇酸(PLGA-COOH，聚合比50∶50，MW：1.2萬，濟南岱罡生物工程有限公司)；紫杉醇原料藥(西安昊軒生物有限公司)；聚乙烯醇(PVA,Sigma)；全氟戊烷(perfluoropentane, PFP,Strem Chemicals)。碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購自Sigma公司。熒光染料DiI、DiO、DAPI、異硫氰酸熒光素(FITC)。人卵巢癌SKOV3細胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所提供。胎牛血清、1640培養(yǎng)液購自Gibco公司。CCK-8購自博奧森公司。

1.1.2 儀器 激光粒徑測量儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern)，聲振儀(Sonics & Materials，美國)，磁力攪拌器，JSM-7800F電子顯微鏡(JEOL，日本)，低功率聚焦超聲治療儀(LIFU)為重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所研制，百盛超聲診斷儀(ESAOTE S.p.A，意大利)，TCSSP2激光共聚焦顯微鏡(Lecia公司，德國)，倒置熒光顯微鏡，高效液相色譜分析儀(Waters e2695，德國)。

1.2 載紫杉醇相變型PLGA納米粒的制備 單乳化法制備載紫杉醇相變型PLGA納米粒(PTX-NPs)。將溶有50 mg PLGA及5 mg PTX的2 ml二氯甲烷溶液、適量PFP及10 ml 5%(W)PVA水溶液充分混合后，于冰水浴中聲振，加入20 ml 2%(V/V)異丙醇水溶液，磁力攪拌器攪拌2～5 h，經(jīng)雙蒸水離心洗滌 2～3次后制得PTX-NPs，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸為5 mg/ml(以加入PLGA的總質(zhì)量計)的溶液，4 ℃冰箱保存。同樣方法，僅在溶解PLGA時不加入紫杉醇原料藥，制備不含紫杉醇的納米粒(NPs)。

1.3 抗CEA單克隆抗體與PTX-NPs的共價連接 抗CEA單克隆抗體(Ab)與PTX-NPs的共價連接采用碳二亞胺法。先將PTX-NPs重懸于MES緩沖液(pH=6.0)中，加入適量EDC及NHS，室溫下?lián)u床孵育45 min，后離心雙蒸水洗滌3次后，MES緩沖液(pH=8.0)重懸PTX-NPs，加入Ab(質(zhì)量比PLGA∶Ab=20∶1)，搖床室溫孵育2～3 h，離心、洗滌后制成靶向CEA載紫杉醇相變型納米粒(Ab-PTX-NPs)。取少許Ab-PTX-NPs用PBS重懸，加入適量FITC標記的山羊抗兔IgG抗體(二抗)，4 ℃搖床孵育1 h，離心、洗滌后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察二者連接情況，流式細胞術(shù)檢測其連接率。

1.4 納米粒的一般特性檢測 光鏡及掃描電鏡下觀察Ab-PTX-NPs的形態(tài)，采用馬爾文粒徑儀檢測其粒徑及表面電位。LIFU致相變后觀察Ab-PTX-NPs相變后超聲顯影情況。取1 ml Ab-PTX-NPs(濃度 10 mg/ml)，離心后采用CH2Cl2溶解沉淀，高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)法檢測溶液中PTX含量，色譜條件：流動相為乙腈∶水=45∶55(V/V)，檢測波長227 nm，進樣量20 μl，并按以下公式計算PTX的包封率及載藥量：PTX包封率(%)=PTX檢出量/PTX總投放量×100%；載藥量(%)=PTX檢出量/Ab-PTX-NPs總重量×100%。恒溫搖床透析法檢測其體外釋藥特性，繪制體外釋藥特性曲線。將一定量Ab-PTX-NPs用PBS重懸，裝入透析袋后放入緩釋液(含30%乙醇)，37 ℃，搖床溫柔搖育，每隔一定時間點采集緩釋液1 ml，HPLC法檢測PTX含量，每次取液后補充等量緩釋液。

圖1 Ab-PTX-NPs形態(tài)特征 A.光鏡圖(×600); B.掃描電鏡圖(×30 000); C.馬爾文粒徑分布圖

1.5 人卵巢癌SKOV3細胞培養(yǎng)及體外尋靶 卵巢癌SKOV3細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、1%鏈霉素—青霉素(雙抗)的1640培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)于 250 ml培養(yǎng)瓶中，置于孵箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，按適當濃度接種于一次性共聚焦培養(yǎng)皿中，分為靶向組、無靶組、抗體阻斷組和陰性對照組。靶向組加入DiI標記的Ab-PTX-NPs；無靶組加入DiI標記的PTX-NPs；抗體阻斷組先加入適量抗CEA單克隆抗體，孵箱孵育2 h，PBS沖洗多次后，再加入等量DiI標記的Ab-PTX-NPs。孵箱孵育45 min后，PBS沖洗多次，加入4%多聚甲醛固定細胞，DAPI染細胞核，PBS沖洗后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組造影劑靶向情況。將細胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔細胞數(shù)為1×105個，各組加入相應(yīng)DiI標記的納米粒，陰性對照組僅加入等量1640培養(yǎng)基，孵箱孵育45 min后，流式細胞術(shù)檢測各組細胞平均熒光強度。

1.6 體外抑制卵巢癌SKOV3細胞生長 取對數(shù)生長期SKOV3細胞，以1×104/孔濃度接種于96孔板，分為靶向組、無靶組、抗體阻斷組、純藥組、無藥組、陰性對照組，每組復(fù)孔數(shù)為5個。靶向組每孔加入100 μl Ab-PTX-NPs(濃度為2 mg/ml，1640培養(yǎng)液重懸)；無靶組每孔加入等量PTX-NPs；抗體阻斷組先每孔加入適量抗CEA單克隆抗體，孵箱孵育2 h，PBS沖洗 3～5次后，每孔加入與靶向組等量Ab-PTX-NPs；純藥組每孔加入含PTX(10 μg/ml)的等量新鮮1640培養(yǎng)液；無藥組每孔加入等量NPs；陰性對照組每孔加入100 μl新鮮1640培養(yǎng)基。各組孵箱培養(yǎng)45 min，PBS沖洗3～5次，并加入100 μl新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵箱培養(yǎng)24 h、48 h后，采用CCK-8試劑法檢測細胞存活率。

2 結(jié)果

2.1 納米粒的一般特性 馬爾文粒徑分析儀檢測Ab-PTX-NPs、PTX-NPs及NPs 3種造影劑粒徑分布分別為(397.70±99.95)nm、(405.80±141.00)nm、(311.00±103.90)nm。光鏡下觀察Ab-PTX-NPs呈圓形，大小均勻，掃描電鏡觀察其形態(tài)呈球形，粒徑大小分布均勻(圖1)。LIFU致相變作用后B模式及造影模式下超聲顯影均顯著增強(圖2)。PTX標準曲線方程為Y=1.356759×105+6.969440×104X(R2=0.999 961)，PTX的包封率及載藥量分別為(67.26±4.15)%和(6.31±0.39)%。體外釋藥特性曲線顯示，紫杉醇釋藥快，且釋藥率高，48 h時釋藥率已近70%(圖3)。

2.2 抗CEA單克隆抗體與PTX-NPs的連接情況 激光共聚焦顯微鏡下觀察到DiI染色的PTX-NPs(紅色熒光)與FITC標記山羊抗兔IgG(綠色熒光)融合呈橙黃色，抗CEA抗體與PTX-NPs成功連接(圖4)。流式細胞術(shù)顯示二者連接率為(92.74±5.75)%(圖5)。

圖2 LIFU致Ab-PTX-NPs相變前后體外超聲顯影情況 相變前B模式(A)和造影模式(B)，相變后B模式(C)和造影模式(D)

圖3 Ab-PTX-NPs中PTX體外釋藥特性曲線

2.3 造影劑靶向SKOV3細胞情況 激光共聚焦顯微鏡顯示靶向組SKOV3細胞周圍見較多帶紅色熒光(DiI染色)的造影劑聚集(圖6)，流式細胞術(shù)檢測靶向組細胞平均熒光強度高于無靶組、抗體阻斷組和陰性對照組(P均<0.05，圖7)。體外抑制細胞生長結(jié)果顯示，24 h時，各組細胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=18.413，P<0.001)，靶向組細胞存活率接近40%，低于無靶組、抗體阻斷組、無藥組和陰性對照組 (P均<0.05)，僅高于純藥組(P<0.05)；48 h時，各組細胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.584，P<0.01)，靶向組的細胞存活率已下降至5%左右，與無靶組、抗體阻斷組、無藥組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，與純藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

3 討論

卵巢癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其治療方式主要為手術(shù)、化療等多模式聯(lián)合治療[6-7]，但化療藥物的直接使用常造成不同程度的毒副作用。紫杉醇作為卵巢上皮性癌化療的核心藥物之一，由于其疏水性，需使用無水乙醇等有機溶劑溶解，增加了其成品藥的毒副作用。隨著超聲分子影像學(xué)的發(fā)展，各種殼成分的納米級超聲造影劑相繼出現(xiàn)[8-10]，使突破腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞間隙，實現(xiàn)對卵巢癌的早期診斷成為可能。PLGA作為一種高分子復(fù)合物，具有較好的生物組織相容性和可降解性，已被諸多學(xué)者[2-3]用于超聲造影研究及藥物和基因遞送的載體。CEA在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達[11]，故可將其設(shè)為靶向研究的靶點。本研究將紫杉醇包載入PLGA制成相變型PLGA納米粒，并將抗CEA單克隆抗體與納米粒共價連接，使其具備CEA靶向性，并通過體外尋靶與抑瘤實驗，探討其體外靶向卵巢癌細胞的效能?？笴EA單克隆抗體與PTX-NPs共價連接采用碳二亞胺法，該方法鏈接效率高，且操作簡便[12-13]。

本研究以PLGA為殼層結(jié)構(gòu)制備Ab-PTX-NPs，包裹PFP作為相變材料，該納米顆粒可順利穿過腫瘤血管內(nèi)皮細胞間隙，當其在腫瘤組織內(nèi)靶向濃聚時，利用超聲波空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)致相變原理[14]，通過LIFU作用致PFP由液相轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀?，納米顆粒隨之轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑴?，從而實現(xiàn)超聲造影的功能；結(jié)果表明，LIFU可成功實現(xiàn)Ab-PTX-NPs相變，從而增強B模式及造影模式超聲顯影。

有學(xué)者[15-16]制備的包裹紫杉醇藥物的PLGA納米粒，其體外釋藥研究均顯示紫杉醇可在一定時間達到較高程度的釋放。本研究制備的Ab-PTX-NPs，體外釋藥快，呈突釋，且在48 h時釋藥率已接近70%。

為提高靶向性，筆者將納米粒與細胞共孵育時間設(shè)定為45 min，以減少因細胞吞噬作用造成的影響。體外尋靶實驗結(jié)果顯示，靶向組細胞平均熒光強度高于其余各組(P均<0.05)，細胞生長抑制實驗結(jié)果表明，在24 h時，靶向組SKOV3細胞存活率接近40%，低于除純藥組外的其余各組(P均<0.05)，48 h時，存活率已下降至5%左右，與純藥組相當，低于其余各組(P均<0.05)，提示靶向CEA載藥PLGA納米粒對卵巢癌SKOV3細胞具有較高的體外靶向與殺傷效能。

本研究的不足：未對所制備的靶向載藥納米超聲造影劑超聲顯影條件進一步優(yōu)化；未評價該納米粒在體內(nèi)的尋靶能力和抗腫瘤效果。

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察抗CEA單克隆抗體與造影劑連接情況(×400) A.FITC標記山羊抗兔IgG呈綠色熒光; B.DiI標記的PTX-NPs呈紅色熒光; C.兩者融合圖 圖5 流式細胞術(shù)顯示抗CEA單克隆抗體與造影劑連接率 A. PTX-NPs； B. Ab-PTX-NPs 圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察Ab-PTX-NPs體外靶向SKOV3細胞情況，紅色為DiI染色的造影劑，藍色為DAPI染色的細胞核(×400) A.靶向組; B.無靶組; C.抗體阻斷組

圖7 SKOV3細胞平均熒光強度 *：與其余各組比較，P<0.05 圖8 24 h、48 h各組SKOV3細胞生長抑制率 *：與其余各組比較，P<0.05；#：兩組間比較，P<0.05；&：兩組間比較，P>0.05

總之，本研究成功制備CEA靶向載紫杉醇相變型PLGA納米粒，該造影劑粒徑小，超聲造影效果好，紫杉醇包封率高，釋藥快，且可特異性靶向卵巢癌細胞表面CEA受體，較好地抑制卵巢癌SKOV3細胞生長。

[1] Zhang F, Zhang ZL. The diagnostic value of transvaginal sonograph (TVS), color Doppler, and serum tumor marker CA125, CEA, and AFP in ovarian cancer. Cell Biochem Biophys, 2015,72(2):353-357.

[2] Mullick Chowdhury S, Wang TY, Bachawal S, et al. Ultrasound-guided therapeutic modulation of hepatocellular carcinoma using complementary microRNAs. J Control Release, 2016,238:272-280.

[3] 周航,黃曉玲,過源,等.鏈霉親和素化載紫杉醇相變型PLGA納米粒的制備及體外超聲顯影.中國介入影像與治療學(xué),2016,13(9):571-575.

[4] 張斌,冉海濤,王志剛,等."適配子-PLGA納米粒"靶向超聲/光聲相變造影劑的制備.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2014,30(11):1609-1613.

[5] Sun C, Panagakou I, Sboros V, et al. Influence of temperature, needle gauge and injection rate on the size distribution, concentration and acoustic responses of ultrasound contrast agents at high frequency. Ultrasonics, 2016,70:84-91.

[6] Schmid BC, Oehler MK. New perspectives in ovarian cancer treatment. Maturitas, 2014,77(2):128-136.

[7] Mittica G, Genta S, Aglietta M, et al. Immune checkpoint inhibitors: A new opportunity in the treatment of ovarian cancer? Int J Mol Sci, 2016,17(7):pii:E1169.

[8] 唐琴,朱深銀,常淑芳,等.兩種相變型多功能納米粒的制備及體外特性比較.中國介入影像與治療學(xué),2016,13(10):636-641.

[9] Zhao YZ, Zhang M, Wong HL, et al. Prevent diabetic cardiomyopathy in diabetic rats by combined therapy of aFGF-loaded nanoparticles and ultrasound-targeted microbubble destruction technique. J Control Release, 2016,223:11-21.

[10] Meng M, Gao J, Wu C, et al. Doxorubicin nanobubble for combining ultrasonography and targeted chemotherapy of rabbit with VX2 liver tumor. Tumour Biol, 2016,37(7):8673-8680.

[11] Sagi-Dain L, Lavie O, Auslander R, et al. CEA in evaluation of adnexal mass: Retrospective cohort analysis and review of the literature. Int J Biol Markers, 2015,30(4):e394-e400.

[12] Jain SK, Haider T, Kumar A, et al. Lectin-conjugated clarithromycin and acetohydroxamic acid-loaded PLGA nanoparticles: A novel approach for effective treatment of H. pylori. AAPS PharmSciTech, 2016,17(5):1131-1140.

[13] 夏瓊,冉海濤,王志剛,等.VCAM-1靶向雙模態(tài)光聲/超聲納米級分子探針的制備及其體外尋靶實驗.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2016,32(3):333-337.

[14] Sheeran PS, Daghighi Y, Yoo K, et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20—40 MHz frequency range. Ultrasound Med Biol, 2016,42(3):795-807.

[15] Esfandyari-Manesh M, Mostafavi SH, Majidi RF, et al. Improved anticancer delivery of paclitaxel by albumin surface modification of PLGA nanoparticles. Daru, 2015,23:28.

[16] Fonseca C, Sim?es S, Gaspar R. Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles: Preparation physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity. J Control Release, 2002,83(2):273-286.

Carcino-embryonic antigen targeted and drug loaded ultrasound nanoparticle agents inhibit growth of ovarian cancer cells in vitro

ZHOUHang1,HUANGXiaoling1*,LIPan2,SHANGTingting2,ZHULeilei2,WANGZhigang2

(1.DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To prepare carcino-embryonic antigen (CEA) targeted and paclitaxel loaded phase-shifting PLGA nanoparticles (Ab-PTX-NPs), and investigate the targeting capability and inhibition to the ovarian cancer cell in vitro. Methods Single-emulsion/solvent evaporation (O/W) and carbodiimide method were used to prepare the Ab-PTX-NPs. The size of nanoparticles was determined by Malvern analyzer. The encapsulation and drug loaded efficiency of paclitaxel were detected by high performance liquid chromatography. And the drug release characteristics was measured by dialysis method in constant temperature shaker. The targeting ability of Ab-PTX-NPs to the ovarian cancer SKOV3 cell was evaluated by the laser scanning confocal microscope and flow cytometry. And the inhibition ability of Ab-NPs was investigated by the CCK-8 assays. Results The size of Ab-PTX-NPs was (397.70±99.95)nm. The encapsulation efficiency and drug loading capacity of PTX were (67.26±4.15)% and (6.31±0.39)%, respectively. The conjugating rate of Anti-CEA antibody was (92.74±5.75)%. The targeting study in vitro showed that such a number of contrast agents landed around the SKOV3 cells in targeting group, and the mean fluorescence intensity of ovarian cells in targeting group was significantly higher than other groups (P<0.05). After 24 h, the viability rate of ovarian cells in targeting group was lower than the non-target group (P<0.05), only higher than that of the pure PTX group (P<0.05). But there was no significant difference between the targeting group and the pure PTX group (P>0.05) at 48 h. Conclusion The CEA targeted and paclitaxel loaded phase-shifting PLGA nanoparticles are successfully prepared. It can enhance ultrasound imaging well after activated by LIFU. With high drug-loading efficiency and fast drug release velocity, the Ab-PTX-NPs appeares great targeted ability.

Ovarian neoplasms; Ultrasonography; Contrast media; Paclitaxel; Targeting therapy

國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(國衛(wèi)醫(yī)辦函[2013]544號)。

周航(1988—)，男，四川雅安人，在讀碩士。研究方向：超聲造影。E-mail: zhouh528@163.com

黃曉玲，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，400016。E-mail: huangxiaoling_4@163.com

2016-11-04

2017-04-14

R445.1； R737.31

A

1003-3289(2017)06-0816-06

10.13929/j.1003-3289.201611023