王攀 莫經(jīng)剛 朱杰 李招云

微滴數(shù)字PCR檢測血清miR-21 和miR-4429在肝癌診斷中的應(yīng)用

王攀 莫經(jīng)剛 朱杰 李招云

目的 應(yīng)用微滴數(shù)字PCR檢測血清中miR-21和miR-4429的水平，并探討聯(lián)合AFP檢測在診斷肝細胞肝癌中的臨床價值。方法 收集69例肝癌、47例慢性活動性乙肝以及40例健康體檢者血清標本，應(yīng)用微滴數(shù)字PCR檢測血清miR-21和miR-4429水平，化學(xué)發(fā)光法檢測血清中AFP水平，并用ROC曲線和Spearman相關(guān)進行分析。結(jié)果 肝癌組患者miR-21水平明顯高于健康對照組和慢性活動性乙肝組（均P＜0.05），miR-4429水平高于健康對照組（P＜0.05）。ROC曲線分析顯示：miR-21、miR-4429和AFP 3者聯(lián)合檢測的靈敏度（95.0%）、特異度（92.5%）和準確度（92.7%），較單獨檢測或兩項聯(lián)合檢測有較大提升。miR-21、miR-4429表達與患者年齡、性別、有無HBsAg感染或肝硬化、PLT或AFP水平、TNM分期和疾病狀態(tài)均無相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)論 血清miR-21和miR-4429對肝癌的診斷具有良好的靈敏度和特異度，聯(lián)合AFP檢測可以提高診斷的效能。

微滴數(shù)字PCR 肝細胞肝癌 miR-21 miR-4429

肝細胞肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，病毒性肝炎和黃曲霉毒素是目前已知的高危致病因子。在我國，由于乙肝病毒的高感染率導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化的高發(fā)，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)病率非常高，約占全球肝癌的55%[1]。目前，手術(shù)切除是臨床常用的治療手段之一，但是由于缺乏早期有效的診斷措施，大部分患者錯過了最佳的手術(shù)時期，以致預(yù)后較差。因此，如何尋找特異度好、靈敏度高的肝癌腫瘤標志物，是肝癌研究者一直努力的方向。筆者采用微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)檢測肝癌患者血清中miR-21和miR-4429水平，并利用化學(xué)發(fā)光聯(lián)合檢測血清AFP，探討3者對于診斷肝癌的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015 年4至9月就診的50例原發(fā)性肝癌患者血清標本，選取臺州市中心醫(yī)院2015年1月至8月就診的19例原發(fā)性肝癌、47例慢性活動性乙肝、40例健康體檢者血清標本。其中肝癌組中男51例，女18例，年齡28～83 （58.8±13.7）歲；慢性活動性乙肝組中男31例，女16例，年齡23～76（53.4±12.7）歲；健康體檢者中男29例，女11例，年齡21～81（55.7±13.0）歲；3組受檢者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。肝癌組患者均符合中華人民共和國衛(wèi)生部肝癌診療規(guī)范（2011年版）的診斷標準，采血前所有患者均未接受化療、放療或手術(shù)治療。

1.2 主要儀器和試劑 miRNeasy Serum/Plasma Kit、miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control、miScriptⅡRT Kit、miScript Primer Assay，hsa-miR-21（Cat.no.）、hsa-miR-4429（Cat.no.MS00041377）miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒均購自德國Qiagen公司，ddPCR儀及試劑盒購自美國BioRad公司；i2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 血清收集 空腹抽取外周靜脈血3ml，室溫靜置1h后，室溫下1 000×g離心10min，吸取血清置-80℃保存。

1.3.2 RNA提取 室溫下血清溶解后，4℃下16 000×g離心15min。取200μl血清按照miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書提取RNA，-80℃保存。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄 取2μl模版RNA配成20μl反應(yīng)體系，按照miScriptⅡRT Kit試劑盒說明書操作，得到的cDNA加200μl無RNA酶水，-20℃保存。

1.3.4 ddPCR 10μl 2X EvaGreen supermix、3.6μl miS-cript Primer Assay、3.6μl miScript Universal Assay、2μl cDNA和0.8μl的去酶水配成20μl PCR反應(yīng)體系。將20μl反應(yīng)液和70μl反應(yīng)油分別加到微滴發(fā)生卡上，通過微滴生成器生成微滴，將40μl微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板上，于PCR儀上進行擴增后，將96孔板放入微滴分析儀，分析每個樣品的微滴，最終得出分析數(shù)據(jù)。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5min，接著40個循環(huán)：變性94℃30s、退火55℃1min，延伸70℃30s，最后4℃5min，90℃5min和4℃保存。

1.3.5 AFP檢測 采用i2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑，按說明書操作。

1.3.6 HBV檢測 采用ELISA法分析，按照科華試劑說明書操作。

1.3.7 PLT檢測 采用SYSMEX XE-2100血細胞分析儀及配套試劑，按照說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較時進行方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett T3法；ROC曲線分析檢測的靈敏度和特異度；差異表達miRNA與肝癌患者臨床病理因素相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 3組受檢者血清中miR-21、miR-4429和AFP水平變化的比較 健康對照組血清中miR-21水平最低，慢性活動性乙肝組中miR-21水平居中，與健康對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；肝癌組血清中miR-21水平最高，與健康對照組和慢性活動性乙肝組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。健康對照組血清中miR-4429水平最低，慢性活動性乙肝組中miR-4429水平居中，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肝癌組血清中miR-4429水平最高，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。健康對照組血清中AFP水平最低，慢性活動性乙肝組中AFP水平居中，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；肝癌組血清中AFP水平最高，與健康對照組和慢性活動性乙肝組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表1。

表1 3組受檢者血清中miR-21、miR-4429和AFP水平的比較

2.2 miR-21、miR-4429和AFP單項檢測和聯(lián)合檢測在診斷肝癌中的ROC曲線分析 3項聯(lián)合檢測與兩項聯(lián)合檢測和單項聯(lián)合檢測比較，可見靈敏度、特異度、準確度和陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值以及ROC曲線下面積均有明顯提高，詳見表2。

2.3 血清差異表達miRNA與肝癌患者臨床病理因素相關(guān)性分析 miRNA-21和miRNA-4429與肝癌患者臨床病理因素均無明顯相關(guān)均（P＞0.05），詳見表3。

3 討論

miRNA是一類長約22nt的小分子非編碼RNA，它主要通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)完全或不完全結(jié)合，降解靶基因mRNA或者阻止其翻譯，從而參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移等生物學(xué)過程。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的細胞分化成熟障礙、增殖失控、遷移轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系[2-3]。有研究表明，來源于腫瘤的miRNA由于避開了內(nèi)源性核糖核酸酶的活性，在血液中能穩(wěn)定存在，并且有一定的表達量，可以作為腫瘤標志物使用[4]。

表2 miR-21、miR-4429和AFP在診斷肝癌中的各項指標

表3 肝癌血清差異表達miRNA與臨床病理因素相關(guān)性分析

目前常用于miRNA分析檢測驗證的是qPCR，但是檢測的過程發(fā)現(xiàn)存在極高的差異性，無法作為穩(wěn)定的檢測標準；并且miRNA應(yīng)用qPCR檢測過程中內(nèi)參的選擇也沒有標準[5]。因此，有需要尋找新的方法用于血清miRNA檢測。研究發(fā)現(xiàn)將ddPCR用于miRNA的檢測能得到較為理想的效果[6-7]。ddPCR是近年來新推出的一種檢測手段。在傳統(tǒng)的PCR擴增前對反應(yīng)液進行微滴化處理，得到20 000個微滴。經(jīng)PCR擴增后，在微滴分析儀上對每個微滴進行逐個分析，將有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性，通過泊松分布原理和陽性微滴的比例計算出靶分子的含量。不受PCR擴增效率的影響，無需制作標準曲線或內(nèi)參，就能得到絕對定量。Hindson[8]采用ddPCR與qPCR對腫瘤相關(guān)miRNA進行方法學(xué)比較分析，得出ddPCR對于血清miRNA的檢測的靈敏度和特異度均高于qPCR。

本研究通過前期二代測序和篩選的工作，將miR-4429納入肝癌聯(lián)合診斷生物標記物，并通過文獻檢索，聯(lián)合miR-21[9-10]通過ddPCR對它們進行驗證。通過研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清中miR-21水平升高，與健康對照組和慢性活動性乙肝組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；肝癌患者血清中miR-4429水平升高，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且慢性活動性乙肝組與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。當miR-21、miR-4429和AFP 3者聯(lián)合檢測時，其靈敏度為95%，特異度為92.5%，準確度為92.9%，較單獨檢測或兩項聯(lián)合檢測有較大幅度的提升，但是與是否HBV感染、TNM分級以及疾病狀態(tài)等卻無明顯相關(guān)。

目前較為確切研究提示，miRNA中調(diào)控肝癌細胞的增值、轉(zhuǎn)移和凋亡的主要有miR-21、miR-26、miR-122。miR-21作為原癌基因，可以通過抑制抑癌基因PTEN，從而加速肝癌細胞生長，增強侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[11]，肝癌患者體內(nèi)miR-21表達量上升提示預(yù)后不良，可以作為診斷肝癌潛在的生物標志物[12]。miR-4429在急性缺血性腦卒中[13]、膽道閉鎖[14]中有相關(guān)報道，而在對于腫瘤細胞的調(diào)控途徑尚不清楚，需要我們進一步的研究分析。

綜上所述，血清miR-21和miR-4429水平在肝癌患者和健康對照組中比較有統(tǒng)計學(xué)差異，可以作為潛在的肝癌腫瘤標志物，在臨床具有一定應(yīng)用前景。但是是否可以作為早期癌變的預(yù)警指示，還需要加大樣品量進一步驗證。

[1] Tang Z Y,Ye S L,Liu YK,et al.A decade's studies on metastasis of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2004, 130:187-196.

[2] Sodhi K K,Bahl C,Singh N,et al.Functional genetic variants in pre-miR-146a and 196a2 genes are associated with risk of lung cancer in North Indians[J].Future Oncol,2015,11(15):2159-2173.

[3] Wu D,Zhou Y,Pan H,et al.microRNA-99a inhibiting cellproliferation,migration and invasion by targeting fibroblast growth factor receptor 3 in bladder cancer[J].OncolLett,2014,7(4):1219-1224.

[4] Mitchell P S,Parkin R K,Kroh E M,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad SciUSA,2008,105:10513-10518.

[5] Shen J,Stass S A,Jiang F.MicroRNAs as potential biomarkers in human solid tumors[J].Cancer Lett,2013,329(2):125-136.

[6] Vojtech L,Woo S,Hughes S,et al.Exosomes in human semen carry a distinctive repertoire of small non-coding RNAs with potential regulatory functions[J].Nucleic Acids Res,2014,42(11): 7290-7304.

[6] Wang P,Jing F,Li G,et al.Absolute quantification of lung cancer related microRNA by droplet digital PCR[J].Biosens Bioelectron, 2015,15(74):836-842.

[7] Hindson C M,Chevillet J R,Briggs H A,et al.Absolute quantification by droplet digitalPCR versus analog real-time PCR[J].Nat Methods,2013,10(10):1003-1005.

[8] 張纓,賈紹昌,項方,等.miR-21在肝癌細胞中的表達及其抑癌基因PTEN的關(guān)系[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2014,19(6):490-493.

[9] 王興,張娟,夏寧,等.血清miR-21及AFP在大鼠肝癌發(fā)生過程中的動態(tài)表達比較分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2012,12(12):2282-2284.

[10] Meng F,Henson R,Wehbe-Janek H,et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology,2007,133(2): 647-658.

[11] Huang C S,Yu W,Cui H,et al.Increased expression of miR-21 predicts poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(6):7234-7248.

[12] Glen C Jickling,Bradley P Ander,Xinhua Zhan,et al.microRNA Expression in Peripheral Blood Cells following Acute Ischemic Stroke and Their Predicted Gene Targets[J].PLoS One,2014,9 (6):e99283.

[13] Rui Dong,Zhen Shen,Chao Zheng,et al.Serum microRNA microarray analysis identifies miR-4429 and miR-4689 are potential diagnostic biomarkers for biliary atresia[J].Sci Rep, 2016,6:21084-21086.

Serum miR-21 and miR-4429 levels detected by droplet digital PCR for diagnosis of hepatocellular carcinoma

WANG Pan，Mo Jinggang，ZHU Jie,et al.Department of Laboratory Medicine,Taizhou Central Hospital,Taizhou 318000,China

Objective To investigate the serum miR-21 and miR-4429 levels detected by droplet digital PCR(ddPCR)in diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC). Methods Serum miR-21 and miR-4429 levels were determined by ddPCR in 69 HCC patients,47 patients with chronic active hepatitis B(CHB)and 40 healthy subjects.Serum AFP levels were measured by chemiluminescence method.ROC curve and Spearman rank correlation were performed data analysis. Results Serum miR-21 levels of HCC group were increased significantly compared with the control group and CHB group(P＜0.05),serum miR-4429 levels increased significantly compared with the normal control group(P＜0.05).ROC curves showed that the sensitivity (95%), specificity(92.5%)and accuracy(92.7%)ofcombination ofmiR-21,miR-4429 and AFP were higher than those ofsingle test or two joint tests.Serum miR-21 and miR-4429 levels were not correlated with age,sex,HBsAg,platelets count,AFP,liver cirrhosis, TNM and disease status(P＞0.05). Conclusion miR-21 and miR-4429 show a good sensitivity and specificity for diagnosis of HCC,and the combination with AFP may further improve the diagnostic efficiency.

ddPCR Hepatocellular carcinoma miR-21 miR-4429

2016-03-22）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃項目資助（2012KYA183）；臺州市市級科技資金項目（121KY09-7）；臺州市市級科技資金項目(14SF04)

318000 臺州市中心醫(yī)院檢驗科（王攀、朱杰、李招云），普外科（莫金剛）

李招云，E-mail:lzy8151@163.com