陳微 曹毅 楊曉紅

紫草素對HaCaT細胞Notch-1信號通路的調節(jié)作用

陳微 曹毅 楊曉紅

目的 研究紫草素對HaCaT細胞抑制增殖的作用及其作用機制。方法 倒置顯微鏡下觀察不同濃度紫草素（0、2、5、10、15μmol/L）作用后HaCaT細胞的形態(tài)學改變；MTT法檢測紫草素對HaCaT細胞抑制增殖的作用；流式細胞術檢測細胞凋亡率變化；Western blot法檢測Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白的表達情況。RT-PCR檢測下游信號分子Hes1和Hes5的mRNA表達。結果 10μmol/L紫草素即可顯著抑制HaCaT細胞的增殖，且隨著濃度的增加，紫草素呈劑量依賴性地抑制HaCaT細胞的增殖（均P＜0.01）。流式細胞術檢測結果顯示10μmol/L紫草素能夠顯著誘導HaCaT細胞凋亡（P＜0.01）。Western bolt法檢測結果顯示，Notch-1、Jagged1和Hes5蛋白表達逐漸降低。RT-PCR法檢測結果顯示，Notch信號通路下游信號分子Hes1和Hes5的mRNA表達水平亦呈劑量依賴性降低。結論 紫草素呈劑量依賴性地抑制HaCaT細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，Notch-1信號通路在其中起了重要作用。

紫草素 HaCaT Notch-1 Jagged1 Hes1 Hes5 細胞凋亡

紫草素是中藥紫草已分離出的有效成分，現(xiàn)代臨床研究認為紫草素對銀屑病治療效果顯著，其作用機制報道顯示紫草素具有抑制與誘導表皮細胞凋亡的能力[1]，但是紫草素通過何種途徑誘導細胞凋亡尚未闡明。Notch信號通路在細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡中起著重要作用，是許多重要細胞信號的交匯點。筆者通過體外研究試驗觀察不同濃度紫草素對人角質形成細胞株HaCaT細胞的影響，并且對Notch-1信號通路3個節(jié)點分子Notch-1、Jagged1和Hes5進行研究，探討其與Ha－CaT細胞凋亡的關系，以期能為銀屑病治療機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人永生化角質形成細胞系HaCaT細胞株由杭州市第三人民醫(yī)院皮膚病研究所惠贈，1640培養(yǎng)基（杭州科易公司），胎牛血清（美國HyCIone公司），2-甲基-正丁酰紫草素（2-Methyl-n-butyl）shikonin（日本東京化成工業(yè)株式會社），四甲基偶氮唑藍（MTT）（Amersco公司），二甲基亞砜（dimethy sulfoxide，DMSO）（天津市天河化學試劑廠），兔抗人多克隆抗體Jagged1、Hes1（美國Santa Cruz公司），兔抗人多克隆抗體Notch-1、鼠抗人單克隆抗體B-actin（武漢博士德公司）。提取rn-RNA所用的Trizol（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（美國ABI公司），實時定量PCR supermix（美國Bio-Rad公司），RT-PCR中所用的引物由上海英駿生物技術有限公司合成。AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物公司）。生物學安全臺（上海上凈凈化公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司），電熱恒溫水槽（上海精宏公司），電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），低溫高速離心機（美國Thermo Forma公司），倒置生物顯微鏡（美國COIC公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio Tek公司），流式細胞儀（美國BD CantoⅡ公司），蛋白印記檢測系統(tǒng)（美國BioRad公司），實時熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HaCaT細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、75%N25%CO2和20% O2環(huán)境中培養(yǎng)，細胞進入對數(shù)生長期后更換新鮮培養(yǎng)液供下一步實驗用。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖情況 將HaCaT接種于96孔板，密度為8.0×104個/ml，放置于孵箱中24h后，細胞長滿板底50%～80%，移出培養(yǎng)基，加入不同濃度紫草素（0、2、5、10、15μmol/L）的紫草素組，每孔設6個復孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml），孵育3h后，吸去孔內的培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，溶解震蕩10min，酶標儀檢測各孔吸光值（490nm），實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞術檢測不同濃度紫草素對細胞凋亡的影響 紫草素對HaCaT細胞干預同1.2.2。用不含EDTA的胰酶消化收集HaCaT細胞（胰酶消化時間不易過長，以防引起假陽性），微量離心機轉速2 000r/ min，離心時間5min，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細胞2次（2 000r/min，離心時間 5min）。用400μl 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106個/ml。在細胞懸浮液中加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入10μlPI后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5min。在1h內用流式細胞儀檢測，觀察細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達 收集各組細胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，上樣30μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜，封閉1h，加一抗（b-actin 1∶1 000，Notch-1 1∶500，Jagged1 1∶150，Hes5 1∶600）4℃15h，加入1:1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h，顯色并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 RT-PCR檢測Hes1和Hes5 mRNA表達 根據(jù)TaKaLa公司試劑盒說明書進行RNA提取，并逆轉錄合成cDNA，從Gene Bank中獲得Notch-1、Hes1、Hes5 mRNA序列，并設計如下引物：Hes1引物序列，上游引物5′-TGGAAATGACAGTGAAGCACCT-3′,下游引物5′-GTTCATGCACTCGCTGAAGC-3′；Hes5的引物序列，上游引物5′-TGGAGAAGGCCGACATCCT-3′，下游引物5′-GGCGACGAAGGCTTTGC-3′。Actin引物序列，上游引物5′-TAAGTAGGCGCACAGTAGGTCTGA-3,下游引物5′-AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG-3′。反應條件：50℃2 min滅活UTG活性，95℃10 min酶熱啟動，95℃15 s變性40循環(huán)，62℃45 s退火及延伸。PCR反應結束后收集溶解曲線判斷反應特異性、SDS documents相對定量方法分析熒光值闡明基因的表達變化。實驗結果以β-actin的mRNA進行標準化。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度紫草素干預后HaCaT細胞生長形態(tài)觀察倒置顯微鏡下正常角質形成細胞貼壁生長，伸展，呈多角形，界清排列緊密。隨著紫草素濃度的增加，細胞變圓或形狀不規(guī)則，細胞貼壁性降低，部分細胞裂解成細胞碎片或脫落，見圖1。

圖1 不同濃度紫草素干預后HaCaT細胞生長形態(tài)觀察（a:空白對照組；b:2μmol/L紫草素組；c:5μmol/L紫草素組；d:10μmol/L紫草素組；e:15μmol/L紫草素組；×100）

2.2 細胞增殖的測定 使用MTT法檢測不同濃度紫草素對HaCaT細胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)紫草素劑量依賴性地抑制其增殖能力，與空白對照組相比，5μmol/L紫草素即可抑制HaCaT細胞增殖（P＜0.01），10μmol/L紫草素基本達到最大的效應（P＜0.01），詳見表1、圖2。

2.3 不同濃度紫草素對細胞凋亡的影響 HaCaT細胞經(jīng)不同濃度紫草素處理后，結果顯示空白對照組凋亡率為2.1%，2μmol/L紫草素及5μmol/L紫草素對HaCaT細胞無明顯促凋亡作用，凋亡率分別為2.3%和3.1%，10μmol/L紫草素可有效促HaCaT細胞凋亡，凋亡率為15%。而15μmol/L促進HaCaT細胞凋亡更加明顯，凋亡率為31%。實驗重復3次，結果相似，見圖2。

表1 紫草素濃度對HaCaT細胞增殖的影響

圖2 流式細胞術檢測不同濃度紫草素對細胞凋亡的影響（3a:空白對照組3b:2μmol/L紫草素組3c:5μmol/L紫草素組3d:10μmol/L紫草素組3e:15μmol/L紫草素組）

2.4 不同濃度紫草素處理后Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達 HaCaT細胞經(jīng)過不同濃度紫草素處理24h后，Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達量呈劑量依賴性降低，見圖3。

圖3 不同濃度紫草素處理后Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達

2.5 不同濃度紫草素處理后HaCaT細胞Hes1和Hes5 mRNA表達 隨著紫草素濃度的增加，Hes1和Hes5 mRNA表達呈劑量依賴性降低，其中 10μmol/L和15μmol/L紫草素處理組Hes1和Hes5 mRNA表達量顯著降低（P＜0.01），見表2。

表2 不同濃度紫草素對Hes1和Hes5 mRNA表達水平的影響

3 討論

銀屑病是一種以角質形成細胞過度增殖及分化異常為特征的炎癥性皮膚病[2]。調節(jié)角質形成細胞的增殖、分化已成為治療銀屑病的重要途徑。很多藥物或者物理療法可以通過抑制角質形成細胞的增殖、誘導其凋亡來達到治療銀屑病的目的[3]。紫草素是傳統(tǒng)中藥紫草的主要有效成分，是一萘醌類化合物，藥理研究證實其抗炎、抗真菌和抗腫瘤等作用顯著[4]，作用機制包括對 DNA拓撲異構酶I、腫瘤血管生成和細胞生長的抑制，以及誘導細胞凋亡等[1]。研究紫草素抗角質形成細胞的增殖及其機制有利于開發(fā)治療銀屑病的中藥制劑。

Notch信號在銀屑病發(fā)病機制中的作用目前研究仍存在分歧。近年來，有文獻支持Notch信號在促進角質形成細胞增殖和抑制凋亡方面發(fā)揮重要作用[5]。在銀屑病皮損中，Notch-1表達明顯增高，在基底細胞層，Notch-l的核穿梭現(xiàn)象較為明顯[6]。Jacques Thelu[7]等檢測銀屑病患者表皮內的Notch分子的表達較健康人下降。作為Notch家族的主要成員之一，Notch-1廣泛存在于多種組織細胞中，有研究證實，Notch-1受體在正常皮膚表皮層均有表達，且在銀屑病患者表皮中顯著高于正常皮膚[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，10μmol/L紫草素即可顯著抑制Ha－CaT細胞的增殖，且隨著濃度的增加，紫草素呈劑量依賴性地抑制HaCaT細胞的增殖。銀屑病皮損中不僅有角質形成細胞的過度增殖同時還伴有細胞凋亡異常，在本實驗中筆者應用流式法檢測不同濃度紫草素對細胞凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)10μmol/L紫草素能夠顯著誘導HaCaT細胞凋亡。進一步研究了紫草素誘導HaCaT細胞凋亡的可能機制，對Notch-1信號通路的3個節(jié)點分子Notch-1、Jagged1和Hes5。Jagged1蛋白是細胞表面的跨膜蛋白，廣泛表達于外周免疫系統(tǒng)的各種細胞[9]，研究已知Jagged1蛋白與Notch受體結合，激活Notch信號通路，從而影響細胞的活化、增殖和分化中發(fā)揮著重要的作用[10]。故筆者選取Jagged1作為活化Notch-1信號的配體。Hes1和Hes5作為Notch-1信號途徑的下游靶基因，其表達與否可以作為Notch-1信號途徑的標志。實驗發(fā)現(xiàn)隨著紫草素濃度的增加，Notch-1、Jagged1、Hes5蛋白的表達量呈劑量依賴性降低，在RT-PCR法檢測中，筆者發(fā)現(xiàn)Notch信號通路下游信號分子Hes1和Hes5的mRNA表達水平亦呈劑量依賴性降低，與Western blot研究結果吻合，因此筆者推斷Notch-1信號通路可能與抑制HaCaT細胞增殖，促進凋亡相關。

總之，本研究結果表明紫草素呈劑量依賴性地抑制HaCaT細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，Notch-1信號通路在其中起了重要作用。但是本實驗僅針對正常HaCaT細胞進行研究，關于對造模后高增殖狀態(tài)下的HaCaT細胞是否有類似作用，有待進一步證實。

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Effects of Shikonin on proliferation of HaCaT Cells

CHEN Wei,CAO Yi,YANG Xiaohong.Department of Dermatology,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005,China

Shikonin HaCaT Notch-1 Jagged1 Hes1 Hes5 Cell apoptosis

2016-11-17）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然科學基金（Y2100759）

310005 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院皮膚科（陳微）；浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院皮膚科（曹毅、楊曉紅）

曹毅，E-mail:caoyi1965@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate effects of Shikonin on proliferation of HaCaT cells and its mechanism. Methods Human immortal keratinocyte HaCaT cells were treated with 0,2,5,10 and15μmol/L of Shikonin．The morphology of cells was observed with inverted microscopy,the growth inhibition rate of HaCaT cells was determined with MTT method,the apoptosis rate was detected by flow cytometer(FCM),the expression of Notch-1,Jagged1 and Hes5 proteins was detected by Western blot;the expression of Hes1 and Hes5 mRNA was detected by RT-PCR. Results MTT assay showed that cell growth was significantly inhibited by shitonin in a dose-dependent manner (P＜0.01).FCM showed that the percentage of apoptotic cells was significantly increased and the cell viability was significantly decreased after HaCaT cells were treated with＞10μmol/L shikonin (P＜0.01)．Western blot showed that the expression of Notch-1,Jagged1 and Hes5 was decreased;and RT-PCR showed that the mRNA expression of Hes1 and Hes5 was also decreased. Conclusion Shikonin can inhibit proliferation and induce apoptosis of HaCaT cells,which may be regulated by Notch-1 signal pathway.