盧 悅，王晶晶，梁廣彬，胡 喆，張良清,

microRNA20b調(diào)節(jié)PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡

盧 悅1，王晶晶1，梁廣彬1，胡 喆2，張良清1,2

目的:觀察microRNA20b對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的影響。方法：采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVECs）建立缺氧/復(fù)氧損傷細胞模型。將生長狀態(tài)良好的HUVECs隨機分為正常對照組（Normal組）、缺氧后陰性對照組（HR+NC組）、缺氧后microRNA20b過表達組（HR+20b組）、缺氧后陰性對照抑制組（HR+IN NC組）和缺氧后microRNA20b抑制組（HR+IN 20b組）。缺氧前24 h采用lipofectamine2000將Negative Control、microRNA20b mimics、inhibitor Negative Control、microRNA20b inhibitor分別轉(zhuǎn)染入后四組細胞，然后缺氧培養(yǎng)12 h后復(fù)氧4 h。采用免疫熒光檢測過氧化物酶體增值物受體γ(PPARγ)蛋白的變化，AnnexinV-FITC/PI流式雙染法檢測細胞的早晚期凋亡率，Western blot檢測PPARγ以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白表達水平。結(jié)果：與Normal組相比，缺氧/復(fù)氧損傷后各轉(zhuǎn)染組PPARγ蛋白表達升高，凋亡率升高。與HR+NC組相比，HR+20b組的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達降低、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達升高，凋亡率降低[(7.70+0.85)%vs(18.20+ 1.05)%,P＜0.05]。與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達升高、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達降低，凋亡率升高[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05]。結(jié)論：microRNA20b靶向作用于PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡。

microRNA20b；過氧化物酶體增值物受體γ；缺氧/復(fù)氧損傷；凋亡

缺血再灌注損傷是臨床冠脈搭橋手術(shù)、冠脈支架以及心臟移植等常見的病理生理現(xiàn)象[1]。由于目前缺血再灌注損傷的整體動物模型受體內(nèi)神經(jīng)、體液的影響，不能確切反映受試藥物對損傷組織的保護作用，而體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞缺氧/復(fù)氧損傷是模擬缺血再灌注損傷的有用模型[2-3]。多項研究表明過氧化物酶體增殖物受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma，PPARγ）可以通過不同途徑減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，縮小缺血再灌注后梗死面積，提示其在這一過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-6]。microRNAs具有在翻譯水平調(diào)控基因表達的作用。作者前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷內(nèi)皮細胞會引起microRNA20b等6個microRNAs的顯著變化。通過前期生物信息學、雙熒光素酶等實驗，作者發(fā)現(xiàn)microRNA20b與PPARγ之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。但是，microRNA20b是否通過PPARγ影響缺血再灌注所致的細胞凋亡，未見國內(nèi)外報道。本研究旨在通過體外建立缺氧/復(fù)氧損傷細胞模型，觀察microRNA20b對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞PPARγ表達及凋亡的影響，探討microRNA20b在調(diào)節(jié)PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PPARγ（美國CST公司，2443），Bcl-2抗體(英國abcam公司，ab32124)，Bax抗體(英國abcam公司，ab32503)，β-actin(Santa公司，sc-477 78)，兔抗（Earthox，E030120），鼠抗（Earthox,E030110），lipofectamine2000（Invitrogen公司），Trizol（Invitrogen公司，11668027），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，RR716）, NegativeControl,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control,microRNA20b inhibitor，(蘇州吉瑪公司)，AnnexinV/PI雙染試劑盒（BD公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 取人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC細胞株，廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中心實驗室提供），復(fù)蘇后加入含l0%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換1次培養(yǎng)液，待細胞80%～90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～4代細胞進行實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的HUVECs隨機分為正常對照組（Normal組）、缺氧后陰性對照組（HR+NC組）、缺氧后microRNA20b過表達組（HR+ 20b組）、缺氧后陰性對照抑制組（HR+IN NC組）和缺氧后microRNA20b抑制組（HR+IN 20b組）。Normal組不做處理正常培養(yǎng)，后四組分別外源轉(zhuǎn)入Negative Control 50nM、microRNA20b mimics 50nM、inhibitor Negative Control 100nM、microRNA20b inhibitor 100nM，轉(zhuǎn)染試劑使用 lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染方法：分別使用 Opti-MEM孵育 lipofectamine2000和microRNAs 5min，混合后共同孵育20 min形成絡(luò)合物后加入細胞中。轉(zhuǎn)染所用的培養(yǎng)基為不含血清和抗生素的培養(yǎng)基，8 h后換成完全培養(yǎng)基。繼續(xù)有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，通過實時定量PCR確認轉(zhuǎn)染成功。

1.4 缺氧/復(fù)氧細胞模型 細胞轉(zhuǎn)染24 h以后，建立缺氧/復(fù)氧細胞模型。缺氧前，將HR+NC組、HR+ 20b組、HR+IN NC組和HR+IN 20b組細胞的完全培養(yǎng)液改為不含糖和血清的培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、95%N2密閉缺氧培養(yǎng)12 h，之后換完全培養(yǎng)基，復(fù)常氧培養(yǎng)4 h；Normal組用完全培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)相同的時間。

1.5 免疫熒光 將生長狀態(tài)良好的HUVECs種在鋪有22 mm×22 mm蓋玻片的六孔板中。待細胞密度達到80%左右，按上述方法對細胞進行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。對處理之后的細胞進行染色。對細胞進行固定、打孔、封閉、孵育一抗及熒光二抗后封片，4℃保存。Leica TCS SP5Ⅱ激光掃描共聚焦顯微鏡，標記每個標本PPARγ的熒光值，并采用IMAGE-PRO PLUS 6.0軟件計算100個細胞中PPAR γ小點的平均個數(shù)。

1.7 流式細胞術(shù) 按上述方法對細胞進行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。消化細胞，200 μL緩沖液稀釋收集各組細胞，然后各組分別加入5 μLAnnexin-V和5 μL PI進行避光染色，再加入300 μL緩沖液混勻，冰上放置10 min即刻流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.8 Western blot 按上述方法對細胞進行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。收集細胞，提取細胞總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍定量蛋白濃度，70 μg上樣，10%SDS-PAGE電泳（60 V/50 min,100 V直到蛋白分離），轉(zhuǎn)膜100 V/ 100 min。封閉1 h,然后使用Bax、Bcl-2、PPARγ及β-actin抗體按1∶1000稀釋（稀釋液為1%脫脂奶），放于4℃冰箱孵育過夜。二抗1∶10000稀釋室溫孵育2 h后ECL化學發(fā)光法檢測相應(yīng)蛋白的表達情況。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ的表達 與Normal組相比，缺氧/復(fù)氧損傷各組PPARγ表達增多；缺氧/復(fù)氧損傷后，HR+ 20b組與HR+NC組相比，PPARγ表達明顯減少，HR+IN 20b組與HR+IN NC組相比，PPARγ表達明顯增多（P＜0.05）。提示microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的PPARγ的表達。見圖1。

2.2 細胞早晚期凋亡率 Normal組細胞早晚期凋亡率為(3.50±0.85)%，HR+NC組為(18.20±1.05)%，HR+20b組、HR+IN NC組和HR+IN 20b組分別為(7.70±0.85)%、(13.80±2.25)%和(18.90±3.05)%。缺氧/復(fù)氧損傷各組與Normal組相比，細胞早晚期凋亡率增加；HR+20b組與HR+NC組相比，凋亡率降低（P＜0.05）；與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組凋亡率升高（P＜0.05）。說明microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡。見圖2。

圖1 各組細胞缺氧/復(fù)氧后PPARγ的表達

2.3 PPARγ、Bax和Bcl-2的表達 與Normal組相比,缺氧/復(fù)氧損傷各組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低；與HR+ NC組相比，HR+20b組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量升高(P＜0.05)；與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低(P＜0.05)。提示microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達，促進抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達。見圖3。

3 討論

圖2 各組細胞凋亡率

業(yè)已證實，PPARγ在缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，因而深入探討PPARγ的表達調(diào)控有助于闡明其在缺血再灌注損傷中的作用及機制。microRNA調(diào)節(jié)是基因表達調(diào)控最為重要的一種調(diào)節(jié)方式[8-10]。本研究中，作者采用免疫熒光技術(shù)分別觀察過表達和抑制microRNA20b對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PPARγ蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達microRNA20b可以減弱PPARγ的表達，而抑制microRNA20b可產(chǎn)生相反的變化，證實microRNA20b對PPARγ的調(diào)控作用。microRNA383也可靶向抑制PPARγ保護實驗動物前腦缺血損傷，提示PPARγ表達可以受多種microRNAs的調(diào)控[11-13]。而研究報道PPARγ可以通過不同途徑調(diào)控細胞凋亡[14]，那么miroRNA20b是否可以通過調(diào)控PPARγ的表達對細胞凋亡產(chǎn)生影響呢？本研究采用流式細胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，過表達microRNA20b可以明顯的降低缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細胞早晚期凋亡率，而抑制microRNA20b的表達可以促進細胞凋亡。這些結(jié)果提示microRNA20b可能通過PPARγ調(diào)節(jié)細胞凋亡。

圖3 各組凋亡相關(guān)蛋白及PPARγ的表達

細胞凋亡是基因控制的細胞自主的程序性死亡，Bcl-2和Bax是凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族的兩個重要成員,二者可通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bcl-2/Bax比值升高，抑制細胞凋亡，反之，則促進細胞凋亡。本研究中，外源轉(zhuǎn)入microRNA20b mimics，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，Bcl-2升高，Bax降低，Bcl-2/Bax比值升高，抑制了細胞凋亡，這與前述實驗結(jié)果一致，提示microRNA20b是通過影響B(tài)cl-2/Bax而減輕細胞凋亡；而有研究發(fā)現(xiàn)[15]沉默PPARγ可以通過上調(diào)Bcl-2的表達從而抑制細胞凋亡。本研究中，轉(zhuǎn)染microRNA20b后PPARγ表達降低，Bcl-2升高，Bax降低，再次證實這一現(xiàn)象。由此可見，microRNA20b可能是通過調(diào)節(jié)PPAR γ影響B(tài)cl-2/Bax復(fù)合物來影響細胞凋亡。

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（收稿：2016-12-22 修回：2017-05-18）

（責任編輯 張淑坤 余劍波）

microRNA20b Inhibits Apoptosis induced by Hypoxia/reoxygenation Injury in Endothelial Cells via Nu?clear Receptor PPARγ

LU Yue,WANG Jing-jing,LIANG Guang-bin,et al.
Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College and Key Laboratory of Organ Damage and Protection of Zhanji?ang City,Zhanjiang(524001),China

Objective To investigate the mechanism of microRNA20b reducing apoptosis induced by hypox?ia/reoxygenation injury.MethodsThe hypoxia/reoxygenation model was created use human umbilical vein en?dothelial cells(HUVECs).HUVECs were divided into 5 groups randomly as normal control group(Normal group), anoxic Negative Control group(HR+NC group),anoxic microRNA20b mimics group(HR+20b group),anoxic in?hibitor Negative Control group(HR+IN NC group)and anoxic microRNA20b inhibitor group(HR+IN 20b group). The last four groups were transfected with Negative control,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control or microRNA20b inhibitor respectively for 24 h.Then the transfected cells were treated with 12 hours hypoxia fol?lowed by 4 hours reoxygenation.Immunofluorescence was used to detect the expression of PPARγ.Annex?inV-FITC/PI double staining apoptosis detection was used to test the apoptosis rate of HUVECs.The expression of Bax、Bcl-2 and PPARγ were determined by western blot.ResultsThe expression of PPARγ was increased after hypoxia/reoxygenation injury compared with Normal group.Compared to HR+NC group,the expression of PPARγ and the apoptosis-related protein Bax were lower in HR+20b group,but the expression of anti-apopto?sis-related protein Bcl-2 was higher.And the apoptosis rate of HR+20b group was lower[(7.70+0.85)%vs (18.20+1.05)%,P＜0.05].Conversely,the cells in HR+IN 20b group expressed higher PPARγ protein and the apoptosis-related protein Bax but lower anti-apoptosis-related protein Bcl-2,also had higher apoptosis rate than HR+IN NC group[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05].ConclusionmicroRNA20b could prevent the hypoxia/reoxygenation injury-induced apoptosis by regulating the expression of PPARγ.

microRNA20b;peroxisome prolif?erative activated receptor gamma;hypoxia/reoxygen?ation injury;apoptosis

R329.2+5

A

1007-6948(2017)03-0283-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.016

國家自然科學基金（81470405）

1.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科（湛江 524001）

2.廣東省湛江市器官功能損傷與保護重點實驗室

張良清，E-mail:zhanglq1970@163.com