包小丹，李天函，郭夢龍，楊威利，李耀華，王文鋒，井長勤

新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng) 453003

離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑對洋蔥的遺傳毒性作用

包小丹，李天函，郭夢龍，楊威利，李耀華，王文鋒，井長勤*

新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng) 453003

為探討咪唑類離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][C1])對洋蔥的遺傳毒性，用濃度分別為2.5、5、10和20 mmol·L-1的[C8mim][C1]處理洋蔥內表皮細胞和洋蔥根尖8 h，用濃度為10 mmol·L-1的[C8mim][C1]處理洋蔥內表皮細胞和洋蔥根尖4 h、8 h、12 h和24 h，研究[C8mim][C1]對洋蔥內表皮細胞核的影響和對洋蔥根尖有絲分裂指數和染色體畸變的影響。結果顯示，與對照組相比，隨著[C8mim][Cl]處理濃度和時間的增加，洋蔥內表皮細胞核偏移率明顯升高，根尖細胞有絲分裂指數顯著降低，染色體畸變現象明顯，畸變率升高。研究表明，當濃度達到 2.5 mmol·L-1時，[C8mim][Cl]對洋蔥具有遺傳毒性。

[C8mim][Cl]；洋蔥；遺傳毒性

離子液體(ionic liquids, ILs)具有許多優(yōu)良的特性，如不揮發(fā)、高熱穩(wěn)定性、不易燃等[1-2]，被作為一類新型的環(huán)境友好型“綠色溶劑”，故它在化學合成、精細化學加工等領域得到廣泛應用，并顯示出了非常好的效果和應用前景[3]。但是，離子液體在生產和使用過程中，可能會流失到環(huán)境中引起環(huán)境污染[4]，在生物體中進行富集且不易降解[5]，對生物體產生嚴重危害。因此有必要對離子液體的毒性進行評估，現在有很多學者研究了離子液體對某些動物、植物、微生物的影響[6-8]。離子液體種類很多，對不同生物體的毒性差異比較大，需對其毒性做進一步研究，為全面評估離子液體的毒性提供更多依據。咪唑類離子液體是最常見、使用最廣泛的一類離子液體，本實驗選用氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim][Cl])為代表研究離子液體的毒性。洋蔥廉價、易于在室內培養(yǎng)，是觀察細胞核和有絲分裂的較佳材料。洋蔥根尖實驗是國際上常用的環(huán)境化學物質遺傳毒性檢測方法，具有靈敏、簡便、快速的特點。因此，本實驗研究了[C8mim][Cl]對洋蔥內皮細胞的影響、對洋蔥根尖細胞分裂和洋蔥染色體畸變的影響，通過研究[C8mim][Cl]對洋蔥的遺傳毒性，探討[C8mim][Cl]對生物體的毒性，為全面評估離子液體的毒性提供更多依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

紅皮洋蔥(Allium cepa)，購自新鄉(xiāng)市農貿市場；[C8mim][Cl]，純度為99.5%，購自湖北恒碩化工有限公司，用純凈水配成1 mol·L-1的母液。

1.2 預處理

挑選完整無損、大小均勻的新鮮洋蔥5顆，撕掉外表皮，去除老根，在室溫下于清水中培養(yǎng)數小時使其活化。

1.3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥內表皮細胞核的作用

切取1 cm2左右的內表皮若干，放入不同濃度(2.5、5、10和20 mmol·L-1)[C8mim][Cl]中處理8 h，對照組使用自來水。處理結束后用改良苯酚品紅染液染色做常規(guī)制片，普通光學顯微鏡下觀察洋蔥內表皮細胞核形態(tài)和位置變化，每張片子選取5～10個視野，觀察1 000個細胞，計算細胞核偏移率。細胞核偏移率等于細胞核邊緣化細胞數量占細胞總數的百分比。

1.4 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥內表皮細胞核的作用

切取1 cm2左右的洋蔥內表皮若干，放入10 mmol·L-1[C8mim][Cl]中處理，在4 h、8 h、12 h和24 h時取樣，用改良苯酚品紅染液染色做常規(guī)制片、觀察、照相，計算細胞核偏移率。

1.5 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響

取正常生長的根長為2 cm的洋蔥，移入不同濃度(2.5、5、10和20 mmol·L-1)[C8mim][Cl]中處理8 h，對照組使用自來水。處理結束后恢復正常培養(yǎng)24 h，剪取根尖，卡諾液固定24 h，保存于4 ℃、70%(體積分數)乙醇中。染色、壓片，在顯微鏡下觀察洋蔥根尖細胞有絲分裂狀況。分裂細胞包括前期、中期、后期、末期的所有細胞，統(tǒng)計1 000個左右細胞中的分裂細胞數，計算有絲分裂指數。有絲分裂指數=分裂細胞數/觀察細胞數(%)[9]。

1.6 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響

取正常生長的根長為2 cm的洋蔥，移入盛有10 mmol·L-1[C8mim][Cl]的小燒杯中，在處理4 h、8 h、12 h和24 h時取樣，恢復正常培養(yǎng)24 h。剪取根尖，卡諾液固定24 h，保存于4 ℃、70%(體積分數)乙醇中。染色、壓片，在顯微鏡下觀察洋蔥根尖細胞有絲分裂狀況，計算有絲分裂指數。

1.7 [C8mim][Cl]處理后對染色體畸變的影響

計算根尖細胞有絲分裂指數后，觀察染色體畸變情況；我們只統(tǒng)計中期、后期和末期的染色體畸變數，每處理組統(tǒng)計約300個分裂相，計算染色體畸變率。染色體畸變率=染色體畸變數/分析的染色體總數(‰)[9]。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果(Results)

2.1 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥內表皮細胞核的作用

未經[C8mim][Cl]處理的洋蔥內表皮細胞核形態(tài)正常，著色較深，位于細胞中央，位置未發(fā)生偏移；經過[C8mim][Cl]處理8 h后，細胞核形態(tài)逐漸發(fā)生變異，并且隨著濃度的增加，細胞核發(fā)生腫脹，著色變淺，核偏移現象嚴重。對照組細胞核偏移率為6.5%，2.5、5、10和20 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理洋蔥內表皮細胞8 h后，細胞核偏移率依次為21.5%、25%、27%和35%，與對照組相比差異性顯著(P<0.05)(圖1)。

2.2 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥內表皮細胞核的作用

[C8mim][Cl]處理時間對洋蔥內表皮細胞核偏移的影響存在差異，隨著[C8mim][Cl]處理時間的延長，細胞核逐漸變大，著色變淺，核偏移現象加重。10 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理4 h、8 h、12 h和24 h后細胞核偏移率依次為19%、27%、32%和53%，各處理組相比差異性顯著(P<0.05)(圖2)。

2.3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響

[C8mim][Cl]造成了洋蔥根尖細胞有絲分裂指數的降低，對照組根尖細胞有絲分裂指數為16.4%，2.5、5、10和20 mmol·L-1[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖8 h后，有絲分裂指數依次為15.1%、13.9%、10.9%和4.6%，隨濃度的增加，有絲分裂指數逐漸降低，與對照組相比，各濃度處理組有絲分裂指數均具有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

圖1 不同濃度[C8mim][Cl]對洋蔥內表皮細胞核偏移的影響注：A 顯微鏡下的圖像，其中a，0 mmol·L-1；b，2.5 mmol·L-1；c，5 mmol·L-1；d，10 mmol·L-1；e，20 mmol·L-1。B 細胞核偏移的量化分析，與對照相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，下同。Fig. 1 Effects of [C8mim][Cl] at different concentrations on nuclear morphological change of onion endothelial cellsNote: A. Onion endothelial cells imaged by microscope; a, 0 mmol·L-1; b, 2.5 mmol·L-1; c, 5 mmol·L-1; d, 10 mmol·L-1; e, 20 mmol·L-1. B. Quantitative analysis of nuclear morphological change of onion endothelial cells; asterisk denotes a response that is significantly different from the control (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). The same below.

圖2 [C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥內表皮細胞核偏移的影響注：A 顯微鏡下的圖像，其中a，4 h；b，8 h；c，12 h；d，24 h。B 細胞核偏移的量化分析。Fig. 2 Effects of [C8mim][Cl] on nuclear morphological change of onion endothelial cells for different treatment timeNote: A. Onion endothelial cells imaged by microscope; a, 4 h; b, 8 h; c, 12 h; d, 24 h. B. Quantitative analysis of nuclear morphological change of onion endothelial cells.

2.4 [C8mim][Cl]不同處理時間對洋蔥根尖細胞有絲分裂的影響

[C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥根尖有絲分裂指數具有明顯的影響，處理4 h、8 h、12 h和24 h后，有絲分裂指數依次為15.3%、12.6%、8.5%和4.1%，隨著處理時間的增長，有絲分裂指數逐漸降低，與對照組相比，各時間處理組有絲分裂指數均有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

2.5 [C8mim][Cl]對洋蔥根尖細胞有絲分裂過程中染色體畸變的影響

[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖細胞后，造成了多種染色體畸變現象的發(fā)生。洋蔥根尖經過[C8mim][Cl]處理后，均有不同類型的染色體畸變，如染色體粘連、染色體橋、斷片、缺失、分配不均、染色體排列紊亂等，其中出現較為頻繁的是染色體粘連及染色體橋(圖5)。隨[C8mim][Cl]處理濃度及時間的增加，染色體畸變率總體呈升高趨勢，但是當處理濃度在10～20 mmol·L-1、處理時間在12～24 h范圍時，染色體畸變率開始下降(圖5)。

圖3 不同濃度的[C8mim][Cl]對洋蔥根尖細胞有絲分裂指數的影響Fig. 3 Effects of [C8mim][Cl] at different concentrations on mitotic index of onion root tip cells

圖4 [C8mim][Cl]處理不同時間對洋蔥根尖有絲分裂指數的影響Fig. 4 Effects of [C8mim][Cl] on mitotic index of onion root tip cells for different treatment time

3 討論(Discussion)

細胞內環(huán)境的穩(wěn)定性對細胞的物質代謝、能量轉換和信息傳遞起著重要的作用。[C8mim][Cl]既具有脂溶性，又具有水溶性，因此比較容易通過細胞膜進入細胞質，作用于細胞器，影響細胞內蛋白質、DNA或其他物質的代謝，引起細胞結構和功能的改變[10]。本研究發(fā)現，[C8mim][Cl]處理洋蔥內表皮細胞后，可引起其細胞核形態(tài)和位置發(fā)生變異，說明[C8mim][Cl]對洋蔥內表皮細胞造成了毒害作用，并且這種毒害作用隨著[C8mim][Cl]的濃度和處理時間的增加而加重。細胞核是細胞內較大的細胞器，正常的細胞核能夠存在于細胞的一定位置，是由于細胞骨架的支撐作用。細胞核位置偏移細胞的中心，可能是因為當細胞處于離子液體的環(huán)境中，離子液體能夠進入到細胞內，直接或間接作用于細胞骨架組裝或去組裝的相關蛋白，引起了細胞骨架的改變，從而改變了細胞核的位置，當離子液體的濃度達到一定程度時，細胞骨架受損嚴重，細胞核缺少支撐作用，緊貼細胞膜分布。

研究表明環(huán)境中的有毒化學物質如鉛和硒等能夠降低植物的有絲分裂指數，其機理是通過阻礙與細胞有絲分裂相關的蛋白質合成，使細胞周期的運行受到抑制，最終導致有絲分裂指數降低。本實驗結果表明，隨著[C8mim][Cl]處理濃度及時間的增加，洋蔥根尖細胞有絲分裂指數呈降低趨勢。[C8mim][Cl]濃度越大，處理時間越長，其在植物體內的積累就越多，胞內分裂相關蛋白的合成受阻就越明顯，有絲分裂指數越低。同時，[C8mim][Cl]能夠促進活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)等的產生，抑制抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等的活性，進而損害DNA，影響脂質及相關蛋白質的合成[11-12]，影響有絲分裂的正常進行，使得有絲分裂指數降低。

當生物體處于不良環(huán)境中時，會引起細胞染色體結構發(fā)生變異，形成染色體斷片、粘連或造成染色體排列紊亂、滯后的現象[13]。研究表明離子液體對水稻、石莼、蠶豆等植物有毒性作用，抑制其生長，造成DNA損傷等[14-17]。本實驗中，[C8mim][Cl]處理洋蔥根尖細胞后，可以引起染色體橋、染色體粘連、缺失等畸變現象的發(fā)生。其發(fā)生的機制可能是通過以下3種途徑，一是[C8mim][Cl]進入細胞核內，將DNA作為靶點，直接損害遺傳物質，當DNA的損傷程度超過DNA的修復能力時，則出現染色體畸變；二是損害與有絲分裂相關的分裂器如紡錘絲，干擾蛋白質合成或RNA的轉錄，不能形成與染色體運動有關的物質，間接引起有絲分裂異常，導致染色體畸變；三是通過干擾某些損傷的正常修復過程，阻止染色體在正常情況下的重建，而形成新的重排，出現染色體橋、粘連、斷片等現象。當[C8mim][Cl]的濃度超過10 mmol·L-1、處理時間超過12 h時，染色體畸變率開始下降，可能是因為當處理濃度及時間達到一定范圍時，離子液體能夠阻礙紡錘絲微管蛋白的聚合作用，致使細胞停留在分裂期。

圖5 [C8mim][Cl]對洋蔥根尖細胞染色體畸變的影響 注：A 顯微鏡下的圖像，下圖為上圖的局部放大圖，其中a，染色體落后；b，染色體粘連；c，染色體排列紊亂、缺失；d，染色體橋；e，染色體斷片(紅色箭頭所指)。B 洋蔥根尖細胞染色體畸變量化分析。Fig. 5 Effects of [C8mim][Cl] on chromosome aberration of onion root tip cells Note: A. Onion root tip cells imaged by microscope; arrow indicates a, chromosome lagging; b, chromosome adhesion; c, chromosome disorder and deletion; d, chromosome bridge; e, chromosome fragments. B. Quantitative analysis of chromosome aberration.

總之，當濃度達到 2.5 mmol·L-1時，[C8mim][Cl]對洋蔥具有遺傳毒性，主要表現為細胞核偏移、有絲分裂異常、染色體畸變等。

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◆

Genotoxic Effects of Ionic Liquid Chloride 1-Octyl-3-methylimidazolium on Onions

Bao Xiaodan, Li Tianhan, Guo Menglong, Yang Weili, Li Yaohua, Wang Wenfeng, Jing Changqin*

College of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China

14 June 2016 accepted 28 August 2016

The aim of this study was to explore the genotoxicity of imidazole ionic liquid chloride 1-octyl-3-methylimidazolium ([C8mim][C1]). Endothelial cells (EC) and root tip cells (RTC) of onion were treated with [C8mim][C1] at the variable concentrations for 8 hours (2.5, 5, 10 and 20 mmol·L-1). Cells were also treated with [C8mim][C1] at the concentration of 10 mmol·L-1for different time period of 4, 8, 12 and 24 hours, respectively. The effect of [C8mim][C1] on onion nucleus was observed, mitotic index was calculated and chromosome aberration of RTC were detected after the treatment of [C8mim][C1]. The results showed that [C8mim][Cl] exposure induced the location change of onion epidermal cell nucleus. In addition, [C8mim][Cl] caused the decrease of mitotic index of RTC and the increase of chromosome aberration ratio. These results demonstrated that the genotoxicity of [C8mim][Cl] on EC and RTC is in a dose- and time-dependent manner when the [C8mim][Cl] concentration reaches 2.5 mmol·L-1.

[C8mim][Cl]; onion; genotoxicity

河南省科技攻關項目(142102310045；152102210126)

包小丹(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為植物生態(tài)毒理學，E-mail: 1057735318@qq.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jingchangqin@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160614001

2016-06-14 錄用日期：2016-08-28

1673-5897(2017)2-102-06

X171.5

A

井長勤(1972-)，男，理學博士，副教授，主要研究方向為細胞和分子毒理學，發(fā)表學術論文30余篇。

包小丹, 李天函, 郭夢龍, 等. 離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑對洋蔥的遺傳毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(2): 102-107

Bao X D, Li T H, Guo M L, et al. Genotoxic effects of ionic liquid chloride 1-octyl-3-methylimidazolium on onions [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 102-107 (in Chinese)