景江，夏林軍，吳菊珍,孫磊

1. 成都工業(yè)學(xué)院，成都 6117302. 泛華建設(shè)集團有限公司成都市政規(guī)劃設(shè)計院，成都 610000

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯對4種藻類生長的影響

景江1,*，夏林軍2，吳菊珍1,孫磊1

1. 成都工業(yè)學(xué)院，成都 6117302. 泛華建設(shè)集團有限公司成都市政規(guī)劃設(shè)計院，成都 610000

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯(敵百蟲)為廣譜殺蟲劑，用途廣泛，但對藻類的毒理學(xué)效應(yīng)研究還有待完善。采用4種受試藻樣，設(shè)置5個敵百蟲濃度組(1、5、10、50和100 mg·L-1)和對照組，實驗周期40 d，藻細胞的初始接種密度106cells·mL-1，光暗比12 h/12 h，24 h曝氣，24 h磁力攪拌，實驗溫度25 ℃，pH 6.8，每隔24 h取樣。結(jié)果表明：5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1濃度的敵百蟲對銅綠微囊藻和小球藻的生長有促進作用，其中以50 mg·L-1濃度組的促進作用最為顯著，促進作用主要表現(xiàn)在生長峰值的延后以及生長對數(shù)期的延長，而高劑量(100 mg·L-1)的敵百蟲則有抑制藻生長的作用。取50 mg·L-1敵百蟲濃度組以及銅綠微囊藻和小球藻作進一步深入研究，結(jié)果表明：50 mg·L-1敵百蟲濃度組的葉綠素a含量峰值比對照組高30%，細胞體內(nèi)的SOD、ATP含量都高于對照組。敵百蟲的使用濃度通常在0.1～1.0 mg·L-1，低于本實驗最佳濃度。本實驗中1 mg·L-1敵百蟲對藻生長影響效果不明顯。

敵百蟲；銅綠微囊藻；小球藻；細胞密度；葉綠素a；SOD；ATP

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯，商品名為敵百蟲，主要成分為90%敵百蟲原粉，80%可溶性粉劑，屬低毒、廣譜殺蟲劑[1]。通過抑制機體乙酰膽堿酯酶使乙酰膽堿在突觸處積累，從而抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，引起生物功能紊亂，導(dǎo)致死亡[2]。不但可以在水稻、棉花等大田作物上防治多種害蟲，也可用于治療魚類的細菌性疾病，防治體外寄生蟲，殺滅寄生在魚體腸道內(nèi)的寄生蟲及浮游動物[3]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，0.1～1.0 mg·L-1敵百蟲通常用于防治水生昆蟲對養(yǎng)殖對象的疾病感染和蠕蟲的體外寄生，同時也可用于控制水體中的浮游生物。但長期反復(fù)使用敵百蟲，將導(dǎo)致殺蟲劑殘留在水體及淤泥中富集，造成水域化學(xué)污染，對魚、蟹、蝦類等非靶標生物中的有益生物產(chǎn)生直接毒性[4]。目前有關(guān)敵百蟲的水生態(tài)毒理學(xué)研究多以水生甲殼類、魚類以及養(yǎng)殖生物為主，藻類毒理學(xué)方面則以淡水藻類為研究重點[5-6]，而有關(guān)海洋微藻研究較少。敵百蟲對魚類和水生動物的毒性很高，半數(shù)致死濃度(LC50)一般為0.05～1 mg·L-1。相對于魚類及水生甲殼類動物，敵百蟲對藻類的毒性較低，72 h或96 h的半效應(yīng)濃度(EC50)一般大于1 mg·L-1[7]；并且環(huán)境中低濃度的敵百蟲等有機磷農(nóng)藥可作為營養(yǎng)源，促進藻類生長[8]。

藍藻是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，平衡穩(wěn)定著整個水生態(tài)系統(tǒng)的。而藍藻的大量生長可以惡化水體的通風(fēng)及光照條件，抑制水體中浮游生物有益種類的生長繁殖，阻礙水中植物的光合作用，擠占其他水生生物的生存空間[9]。藍藻生命力強，越冬期生活在湖泊的底泥中，遇到適合其生長的外部環(huán)境條件時，再次復(fù)蘇[10]。

本文選用4種藻類作為受試對象，分別為銅綠微囊藻、魚腥藻、普通小球藻、念珠藻，其中小球藻屬于綠藻，是養(yǎng)殖水體中常見的主要藻類之一，且與一些藍藻形成一定的競爭效應(yīng)[11-12]。如表1所示，所選藻類都屬于常見藻，但特征、習(xí)性、分布都具有一定的差異性[13-17]。本文通過實驗，研究不同濃度的敵百蟲對4種藻類是否有影響，是否能夠促進或者抑制藻類的生長，以及在藻類的對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等生命周期中有何影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

藻種：魚腥藻PCC 7120(Anabaena sp. PCC 7120)，Allen’s培養(yǎng)基；普通小球藻CHX-1(Chlorella sp. CHX-1)、念珠藻106(Nostoc sp.106)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)，BG11培養(yǎng)基；藻種由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)提供，培養(yǎng)溫度為25 ℃，可見光照強度2 000 Lux，pH 6.8，實驗前，在對數(shù)生長期接種2～3次，使藻種保持良好的活性，并達到同步生長。

表1 實驗藻種Table 1 Experimental algae

Allen’s培養(yǎng)基：1.50 g·L-1NaNO3，0.038 g·L-1MgSO4·7H2O，0.013 g·L-1CaCl2·2H2O，0.03 g·L-1檸檬酸，0.04 g·L-1K2HPO4，0.02 g·L-1Na2CO3，0.029 g·L-1Na2SiO3·9H2O，1 mL·L-1金屬元素溶液PIV。

BG11培養(yǎng)基：1.50 g·L-1NaNO3，0.04 g·L-1K2HPO4·3H2O，0.075 g·L-1MgSO4·7H2O，0.036 g·L-1CaCl2·7H2O，0.001 g·L-1Na2EDTA，0.02 g·L-1Na2CO3，0.006 g·L-1檸檬酸，0.006 g·L-1檸檬酸鐵銨，1 mL·L-1微量元素A5溶液。

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯(敵百蟲)，由成都科龍化工試劑公司提供，分析純(AR)；其余所用試劑均為分析純(AR)，由成都科龍化工試劑公司提供。

實驗儀器包括：高速臺式離心機H3—18KR(重慶松朗儀器有限公司)，超聲波細胞粉碎機JY92—Ⅱ(寧波新芝生物科技有限公司)，可見分光光度計721G(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，生化培養(yǎng)箱LRH—250 (上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 敵百蟲對藻生長影響實驗

將生長至對數(shù)期的銅綠微囊藻接種于6個1 000 mL錐形瓶中，藻液接滿1 000 mL。設(shè)置5個敵百蟲濃度組(1、5、10、50和100 mg·L-1)和1個對照組，實驗周期40 d。藻細胞的初始接種密度106cells·mL-1。光暗比12 h/12 h、24 h曝氣、24 h磁力攪拌，實驗溫度25 ℃，pH 6.8，每隔24 h取樣分析。其他3種藻樣的實驗方法、條件相同。

實驗采用2種培養(yǎng)基，其中營養(yǎng)鹽總氮(TN)、總磷(TP)起始濃度相同，均為245 mg·L-1與7.2 mg·L-1。實驗周期中保證TP、TN濃度始終維持在超富營養(yǎng)狀態(tài)。總氮和總磷的測定分別采用硫酸肼還原法和鉬藍法(國家海洋局，2007)[18]。

1.3 藻密度的吸光度值測定

參照劉加慧等[19]和郝聚敏等[20]的方法，取對數(shù)生長期藻細胞培養(yǎng)液，稀釋成不同藻細胞數(shù)量，用分光光度計測680 nm下的光密度值(OD680)，每天定時取樣測定，每組設(shè)3個平行樣。得到680 nm的光密度值與藻細胞數(shù)量的相關(guān)關(guān)系，相應(yīng)的回歸方程為：小球藻細胞濃度(萬個·mL-1)=1557OD680-34.716，以光密度值代表小球藻的生長情況。

4種藻類的相關(guān)關(guān)系有差異性，其他3種藻類也通過此實驗方法得到680 nm與藻細胞數(shù)量的關(guān)系。

1.4 葉綠素a(Chl a)測定實驗

采用分光光度法，根據(jù)Hall和Rao[21]的方法略做改進。每隔24小時取5 mL(定為V1)藻液于10 mL離心管中，超聲破碎30 s(工作時間1 s，間隔2 s)，在樣品中加入20 μL 1%(質(zhì)量分數(shù))的MgCO3溶液，8 000 r·min-1下離心15 min，棄去上清液。在沉淀中加入3 mL丙酮溶液，于4 ℃冰箱中過夜萃取18～24 h，于7 000 r·min-1下離心10 min，取上清液，分別測定750、663、645和630 nm的OD值，取上清液的體積為V2，利用下式計算Chl a(mg·mL-1)：

Chla=[11.64×(OD663nm-OD750nm)-2.16

×(OD645nm-OD750nm)+0.1(OD630nm-OD750nm)]

V2(mL)/V1(mL)

1.5C-PC藻藍蛋白含量的測定

參照Padgett和Krogmann[22]的方法，在分光光度計下測量藻藍蛋白在620nm和650nm的OD值，用以下公式計算：

C-PC(mg·mL-1)=(166×OD620nm)-(108×OD650nm)

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

SOD的測定根據(jù)Stewert(1980)的方法[23]，在25 ℃，在4.5mL的50mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入待測樣品的SOD粗酶液，再加入10μL50mmol·L-1連苯三酚，迅速搖勻，將搖勻的反應(yīng)液立即倒入光徑為1cm的比色杯內(nèi)，分光光度計325nm波長下每隔30s測OD值(A)一次，要求連苯三酚的自氧化速率控制在0.07A·min-1左右，對照管取10mmol·L-1HCl代替。測得數(shù)據(jù)按下式計算：

酶活性(U·mL-1)=[0.07-OD325nm/時間(min)]/0.07×100%/50%×反應(yīng)液總體積(mL)×樣液稀釋倍數(shù)/樣液體積(mL)

1.7ATP含量的間接測定法

ATP含量的測定采用《環(huán)境工程微生物檢驗手冊》[24]中的方法，取1cm2的藻樣，將其加入裝有1mL蒸餾水的比色管中，完全混合，加入2.5mL質(zhì)量分數(shù)為95%的硫酸，然后用紗布蓋上用繩扎緊，置高壓鍋加壓，128 ℃，15min后取出。室溫下冷卻后，加1～2滴過氧化氫液，搖勻，用去離子水稀釋，此為消化液。取2支試管，其中1支加入消化液3mL，搖勻，另1支加蒸餾水3mL，各管加定磷試劑3mL后，同置45 ℃水浴25min，取出冷卻至室溫，在721G分光光度計上660nm處比色測定。

2 結(jié)果(Results)

2.1 敵百蟲對4種受試藻生長速度的影響

由圖1所示，敵百蟲加入后，4種藻樣的生長均受到了不同程度的影響，其中以銅綠微囊藻和小球藻最為明顯。在銅綠微囊藻的實驗中，敵百蟲濃度為50mg·L-1時，藻受到的影響最大，對數(shù)生長期持續(xù)時間比對照樣品長，50mg·L-1濃度組的藻在25d后進入生長穩(wěn)定期，并且一直保持著高活性，對照組第40天已經(jīng)進入衰亡期，細胞密度持續(xù)減少，而50mg·L-1濃度組細胞密度達到32×106cells·mL-1，比對照組高出80%，生長穩(wěn)定，沒有進入衰亡期。在小球藻的實驗中，不同濃度組的敵百蟲均對小球藻的生長產(chǎn)生了影響，其中50mg·L-1濃度組對小球藻生長有較明顯的促進作用，而高濃度組100mg·L-1對小球藻的生長有抑制作用，在40d的實驗周期中，最高細胞密度達到15×106cells·mL-1，僅為對照組的75%，說明高濃度的敵百蟲對小球藻有毒害作用，抑制了藻的生長；但進入衰亡期后，細胞衰減速度較緩慢，第40天時，細胞密度為對照組的85%，相對而言有所上升，說明隨著實驗時間的延長，敵百蟲產(chǎn)生生物降解或者水解，小球藻發(fā)生補償生長，而同樣的情況也出現(xiàn)在魚腥藻和念珠藻的實驗中。王秀紅等[25]發(fā)現(xiàn)丁草胺濃度在4～20mg·L-1范圍內(nèi)可促進3種魚腥藻生長，大于20mg·L-1時抑制生長。此結(jié)果與本文實驗現(xiàn)象有一定的相似性，說明一定濃度的有敵百蟲對藻的生長有促進作用，而濃度高于臨界點后就會出現(xiàn)抑制作用，本文結(jié)果顯示，100mg·L-1敵百蟲超出了臨界濃度，對藻前期生長抑制力度很強，對藻有明顯的致害作用，生命周期內(nèi)的藻活性較低，與其他濃度組差異性較大。

藍藻的生命周期一般為30d，而由于有機磷農(nóng)藥敵百蟲的加入，影響了藍藻的生命周期，由傳統(tǒng)的適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的規(guī)律性生命周期變得不規(guī)律，整個生命周期有所延長是實驗中較明顯的特征。因此，選擇銅綠微囊藻和小球藻以及敵百蟲50mg·L-1濃度組，做進一步研究實驗。

圖1 敵百蟲對藻生長的影響注：a-銅綠微囊藻；b-魚腥藻；c-小球藻；d-念珠藻。Fig. 1 Effect of trichlorfon on the growth of algaeNote: a-Microcystis aeruginosa; b-Anabaena sp. PCC 7120; c-Chlorella sp. CHX-1; d-Nostoc sp.106.

2.2 葉綠素a含量影響

在藻的光合作用中葉綠素a是不可缺少的催化劑，綠素a的含量直接反應(yīng)了藻生長代謝的活性[26]。由圖2所示，在銅綠微囊藻的實驗中，敵百蟲50 mg·L-1濃度組在進入生長穩(wěn)定期后綠素a含量在25 d時達到峰值，同期比對照組高出30%，在衰亡期時，敵百蟲50 mg·L-1濃度組葉綠素a含量呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢，但仍然保持著一定的活性。相似的情況也出現(xiàn)在小球藻的實驗中，由此可見，50 mg·L-1敵百蟲濃度組對藻的生長有正面刺激作用，細胞生長代謝活性較高，峰值延后說明延長了藻的生長對數(shù)期時間。

圖2 敵百蟲對藻葉綠素a的影響注：a-銅綠微囊藻；b-小球藻。Fig. 2 Effect of trichlorfon on the algal Chl a Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

2.3 藻藍蛋白(C-PC)含量的影響

藻藍蛋白與葉綠素a在藻的光合作用中起著同等重要的作用，在藻類細胞中光合作用的一部分，將捕獲的光能傳遞給葉綠素a[27]。

由圖3所示，銅綠微囊藻對照組C-PC含量在20 d達到峰值，而敵百蟲50 mg·L-1濃度組延遲到第25天達到峰值，且高出對照組30%，其生長對數(shù)期持續(xù)時間更長。在小球藻的實驗中，生命周期延長的現(xiàn)象明顯，峰值延遲。40 d時，敵百蟲50 mg·L-1濃度組藻細胞內(nèi)C-PC含量仍較高，說明其體內(nèi)活性蛋白較多，補光系統(tǒng)、光合作用系統(tǒng)完整。

圖3 敵百蟲對藻藍蛋白(C-PC)含量的影響注：a-銅綠微囊藻；b-小球藻。Fig. 3 Effect of trichlorfon on the phycocyanin (C-PC) Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

2.4 ATP含量的影響

微生物體內(nèi)ATP可以指示其生物活性[28]。線粒體產(chǎn)生ATP為細胞內(nèi)進行的大多數(shù)生命過程提供了能量，ATP合成復(fù)雜，主要是由包埋在線粒體內(nèi)膜中的一系列的分子復(fù)合物，借助O2從營養(yǎng)物獲取能量制造ATP，不幸的是線粒體從營養(yǎng)物中獲得能量的同時作為副產(chǎn)物產(chǎn)生了自由基(如O2·-，H2O2，·OH)。為了清除這些游離的自由基，以防止細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，由SOD作出的抗氧化動態(tài)平衡使細胞得到了保護，但周期末期正常藻細胞發(fā)生衰亡，導(dǎo)致上述的動態(tài)平衡失衡，膜脂質(zhì)過氧化，從而破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，致使葉綠素含量下降，細胞生長受阻[29]。圖4所示，銅綠微囊藻在進入生長穩(wěn)定期后，敵百蟲50 mg·L-1濃度組生長活性一直高于對照組，且下降趨勢較對照組緩慢。小球藻在對數(shù)生長期ATP含量，敵百蟲50 mg·L-1濃度組低于對照組，但是對數(shù)期延續(xù)時間長，且峰值含量高于對照組，說明小球藻在初期可能受到敵百蟲的致害影響，而后期敵百蟲含量降低后，出現(xiàn)了超補償生長。

圖4 敵百蟲對藻ATP含量的影響注：a-銅綠微囊藻；b-小球藻。Fig. 4 Effect of trichlorfon on the algal ATP Note: a-Microcystis aeruginosa; b- Chlorella sp. CHX-1.

2.5 SOD含量的影響

在葉綠體中，O2·-活性氧的清除是通過SOD酶來催化完成的，當(dāng)這種清除體系遭到破壞時，導(dǎo)致O2·-積累，進而引起H2O2積累，就會導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，從而破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，致使葉綠素含量下降，細胞生長受阻[30]，因此SOD含量的高低代表了藻細胞抗氧化功能的強弱，也反應(yīng)了藻細胞的抵抗能力，圖5可見，銅綠位囊藻與小球藻在生長末期細胞體內(nèi)的SOD含量，敵百蟲50 mg·L-1濃度組均高于對照組，同比其生長對數(shù)期分別降低了14%和10%，對照組SOD含量正常下降約60%，說明藻細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)不能保持平衡，藻細胞的抵抗力較差，死亡率大于生長率。Wu等[31]研究表明，藍藻在銅的作用下，SOD和過氧化氫酶活性均比空白顯著增加，其增加的SOD活力用于對抗增加的氧化壓力。與本實驗結(jié)果有很大的相似性，說明敵百蟲濃度組細胞體內(nèi)基本能夠維持抗氧化功能，抗氧化壓力明顯高于對照組，在生長末期的抗逆能力顯著增加。

圖5 敵百蟲對藻SOD含量的影響注：a-銅綠微囊藻；b-小球藻。Fig. 5 Effect of trichlorfon on the algal SOD activity Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

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Toxic Effects of 0,0-Two-(2,2,2-Three Chloro-1-Hydroxy Ethyl) Phosphate on Four Kinds of Algae Growth

Jing Jiang1,*, Xia Linjun2, Wu Junzhen1, Sun Lei1

1. Chengdu Technological University, Chengdu 611730, China2. Chengdu Municipal Planning and Design Institute, FanHua Construction Group Limited Company, Chengdu 610000, China

12 Semptember 2016 accepted 4 January 2017

0,0-two-(2,2,2-three chloro-1-hydroxy ethyl) phosphate (trichlorfon) is widely used as pesticides, while its toxic effect on algae is still not well understood. The experiment adopts four algal species to be exposed to 5 different trichlorfon concentration groups (1, 5, 10, 50, 100 mg·L-1) and 0 mg·L-1as control group. The experimental period is 40 days, and the initial inoculation density of algal cells is 106cells·mL-1with the light dark ratio 12 h/12 h, 24 h aeration, 24 h magnetic stirring, the experimental temperature 25℃, pH 6.8. Samples are taken in every 24 h. Results show that 5 mg·L-1, 10 mg·L-1and 50 mg·L-1of trichlorfon has a promoting effect on the growth of Microcystis aeruginosa and Chlorella sp. CHX-1, and thereinto 50 mg·L-1group has the most significant effect. The promoting effect is mainly manifested in the delay of the growth peak and the extension of the exponential phase, and high doses of trichlorfon (100 mg·L-1) inhibit the growth of algae. The further study shows that the peak of algal Chl a in 50 mg·L-1trichlorfon group is 30% higher than the control group, and the SOD content and ATP content in the cells are higher than control group. Working concentration of trichlorfon is 0.1-1.0 mg·L-1, which is lower than the concentration of this study. The 1 mg·L-1trichlorfon group has no obvious effect on the growth of algae.

trichlorfon; Microcystis aeruginosa; Chlorella sp; cell density; Chl a; SOD; ATP

四川省科技廳重點項目(2011ZR0139)；四川省教育廳項目(15ZB0309)

景江(1982-)，男，講師，碩士，研究方向為地表水環(huán)境、藍藻水華治理，E-mail: 25859260@qq.com；

10.7524/AJE.1673-5897.20160912004

2016-09-12 錄用日期：2017-01-04

1673-5897(2017)2-094-08

X171.5

A

景江, 夏林軍, 吳菊珍, 等. 0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羥基乙基)磷酸酯對4種藻類生長的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 94-101

Jing J, Xia L J, Wu J Z, et al. Toxic effects of 0,0-two-(2,2,2-three chloro-1-hydroxy ethyl) phosphate on four kinds of algae growth [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 94-101 (in Chinese)