謝康，劉艷秋，陽彥，陸青，夏秋平

(江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西南昌330006)

母乳、小兒血液及尿液標本中檢測巨細胞病毒對診斷小兒HCMV感染的臨床應(yīng)用

謝康，劉艷秋，陽彥，陸青，夏秋平

(江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西南昌330006)

目的探討不同種類的標本中人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)的檢測對診斷小兒感染HCMV的價值。方法采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測458例臨床疑似HCMV感染的患兒尿液、血液和母乳中HCMV-DNA，運用化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測患兒血清HCMV-IgM抗體水平，并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果458例患兒中，母乳HCMV-DNA的總檢出率最高，達52.6%。新生兒組母乳HCMV-DNA陽性率（55.6%）明顯高于尿液（7.0%）和單個核細胞（13. 4%），也遠高于血清HCMV-IgM陽性率（4.2），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；嬰兒組尿液HCMV-DNA檢出率最高（59.8%），顯著高于單個核細胞HCMV-DNA（24.3%）和血清HCMV-IgM（22.2%）的陽性率，但與母乳HCMV-DNA（51.3%）陽性率無明顯差異（P＞0.05）。母乳HCMV-DNA與患兒尿液HCMV-DNA（r=0.778）、單個核細胞HCMV-DNA（r=0.395）及血清HCMVIgM（r=0.332）陽性率均呈顯著正相關(guān)。結(jié)論根據(jù)年齡段選擇HCMV的樣本送檢，對提高檢出率具有重要價值，聯(lián)合母乳、患兒尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測可明顯提高患兒HCMV感染檢測的陽性率。

人類巨細胞病毒；小兒；實時熒光定量PCR；化學(xué)發(fā)光法；母乳

人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種屬于具有雙鏈DNA的皰疹類病毒，具有高度種屬特異性和潛伏-活化的生物學(xué)特征[1]。該病毒在全球廣泛流行，發(fā)達國家的感染率為30%～70%，我國人群的感染率在90%以上，尤以孕婦、嬰幼兒等免疫功能低下的人群更為常見[2]。HCMV感染大多數(shù)表現(xiàn)為無癥狀的隱形或潛伏感染，該病毒是孕婦圍生期感染的重要病原微生物之一，可通過胎盤、血液或者母乳等途徑直接傳播給嬰兒，可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)等，嚴重影響胎兒的健康；也可導(dǎo)致嬰兒黃疸、肝脾腫大、皮膚出血點及淤斑等，重癥病死率高，并可導(dǎo)致運動、聽力、視力及智力等多種嚴重的后遺癥[3，4]。因此，HCMV感染的早期診斷及預(yù)防顯得尤其重要。

本研究運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）檢測疑似HCMV感染小兒血、尿及母乳中HCMV-DNA含量，同時采用化學(xué)發(fā)光法檢測其血清HCMV-IgM水平，探討不同種類的標本不同檢測指標在小兒HCMV感染疾病中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年1月至2016年6月在江西省婦幼保健院疑似HCMV感染的住院患兒458例，年齡均≤1周歲，并按年齡分成兩組。其中新生兒組（0≤年齡≤28d）共142例，男83例，女59例；嬰兒組（29d≤年齡≤1周歲）共316例，男195例，女121例。

1.2 標本收集清潔患兒外陰，留取新鮮尿液2～5ml于干凈無菌試管中；母乳采集用自我擠壓法（不用吸奶器），清潔乳頭后擠出乳汁5ml于干凈無菌試管中，留取的標本立即送往實驗室，如不能立即檢測，標本置4℃冰箱中保存，24h內(nèi)完成檢測。同時抽取患兒靜脈全血2ml（EDTA-K2抗凝）用于HCMV-DNA檢測，促凝管采集靜脈全血2ml用于HCMV-IgM檢測。

1.3 標本處理乳汁、尿液標本：充分混勻后吸取1ml于無菌離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，取沉淀?？鼓軜吮荆夯靹蚝笕DTA抗凝全血1ml，沿試管壁緩慢加入裝有淋巴細胞分離液的無菌試管中，1500r/min離心15min，吸取中間單個

1.4 試劑、儀器與樣本檢測FQ-PCR檢測采用中山醫(yī)科大學(xué)達安基因診斷公司CMV-DNA熒光定量試劑盒。實時熒光定量PCR擴增儀為美國ABI7500。上述標本處理后的母乳沉淀、尿液沉淀和單個核細胞沉淀分別加入DNA提取液混勻，100℃保溫10min，12000r/min離心5min，取上清5μl作PCR反應(yīng)。循環(huán)條件為93℃2min預(yù)變性，93℃45s→55℃60s→共10個循環(huán)，最后按93℃30s→55℃45s→共30個循環(huán)，于55℃45s末收集熒光信號。根據(jù)陽性定量參考品的CT值作標準曲線，通過樣品的CT值計算DNA病毒載量，DNA拷貝數(shù)≥500copies/ml結(jié)果為陽性，DNA拷貝數(shù)＜500 copies/ml為陰性。HCMV IgM抗體檢測試劑盒和全自動免疫分析儀Cobas E-601均購自德國羅氏診斷有限公司，且HCMV-IgM≥1.0COI(cutoff index)為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法，陽性率相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 458例疑似HCMV患兒中各種標本的陽性率比較如表1所見，458例疑似HCMV感染患兒中母乳標本HCMV-DNA的檢出率最高（52.6%），顯著高于單個核細胞HCMV-DNA（21.0%）及血清HCMV-IgM的檢出率（16.6%）（P＜0.05），但與尿液HCMV-DNA的檢出率（43.4%）無明顯差異（P> 0.05）。

2.2 新生兒組四種檢測標本HMCV陽性率的比較新生兒組中，142例疑似感染HCMV患兒的母乳標本中HCMV-DNA陽性率達55.6%，明顯高于尿液（7.0%）、單個核細胞（13.4%）及血清中HCMVIgM的陽性率（4.2%），P值均小于0.01。單個核細胞HCMV-DNA陽性率均高于尿液HCMV-DNA與血清HCMV-IgM的陽性率（P＜0.05），而尿液HCMV-DNA與血清HCMV-IgM的陽性率無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.3 嬰兒組四種檢測標本HMCV陽性率的比較表1中可見，嬰兒組中，316例疑似感染HCMV患兒的母乳HCMV-DNA陽性率與尿液HCMV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均高于單個核細胞HCMV-DNA陽性率和血清HCMV-IgM的陽性率（P均小于0.01）。而后兩者間的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 新生兒組和嬰兒組HCMV-DNA和HCMVIgM陽性率的比較表1中，除母乳HCMV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，新生兒組尿液HCMV-DNA、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM的陽性率均低于嬰兒組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 HCMV-DNA與HCMV-IgM陽性率中的性別差異兩組患兒中，男性與女性間的母乳、尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，P值均大于0.05（表1）。

表1 458例小兒疑似HCMV感染母乳、尿液、單個核細胞及血清檢測情況

2.6 母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、單個核細胞HCMV-DNA陽性率及血清HCMV-IgM陽性率的相關(guān)性分析表2中可見，母乳檢測中HCMVDNA陽性的共有241例，陰性217例，陽性率52.6%。其中，在患兒尿液HCMV-DNA陽性的199例中，母乳HCMV-DNA陽性共178例，占89.4%（178/199），患兒尿液HCMV-DNA陰性的259例中，母乳HCMV-DNA陽性共64例，占24.7%（64/ 259），兩者差異顯著（P＜0.01）；在患兒單個核細胞HCMV-DNA陽性的96例中，母乳HCMV-DNA陽性88例，占91.7%（88/96），患兒單個核細胞HCMV-DNA陰性的362例中，母乳HCMV-DNA陽性共151例，占41.7%（151/362），兩者比較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在患兒血清HCMV-IgM陽性的76例中，母乳HCMV-DNA陽性67例，占88.2%（67/76），患兒血清HCMV-IgM陰性的382例中，母乳HCMV-DNA陽性共159例，占41.6%（159/382），兩者比較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步進行Spearman等級相關(guān)分析得出，母乳HCMV-DNA陽性率與患兒尿液HCMV-DNA陽性率（r=0.788，P＜0.01）、單個核細胞HCMV-DNA陽性率(r=0.395，P＜0.01)及血清HCMV-IgM陽性率（r=0.332，P＜0.01）均呈正相關(guān)。

3 討論

HCMV屬皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒，又稱為人類皰疹病毒5型，其直徑約180～250 nm，在人群中感染十分普遍，尤其是孕婦、嬰幼兒等免疫功能低下的人群[5]，然而嬰幼兒感染HCMV早期很多無癥狀，呈隱形感染，將來有可能發(fā)展為智力低下，聽力受損等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[6，7]。隨著特異性抗CMV病毒更昔洛韋的應(yīng)用，如何早期、快速而準確地診斷CMV感染成為監(jiān)測CMV感染狀態(tài)、給予合理的治療及判斷療效、預(yù)后的關(guān)鍵。

表2 母乳HCMV-DNA與小兒尿液、單個核細胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM的相關(guān)性

目前，臨床檢測HCMV方法包括直接檢查、血清學(xué)診斷、病毒培養(yǎng)、抗原檢測、熒光定量PCR技術(shù)檢測母乳、血、尿DNA含量[8，9]。本研究根據(jù)患兒年齡進行分組，分別檢測新生兒組與嬰兒組母乳、尿液、單個核細胞中HCMV-DNA含量及血清中HCMV-IgM水平，并進行結(jié)果分析。結(jié)果顯示，458例疑似HCMV感染患兒中母乳標本HCMV-DNA的總陽性率高達52.6%，與國內(nèi)文獻報道結(jié)果相近[10]，推測HCMV感染母乳可能是小兒感染HCMV的主要途徑之一。在新生兒組中，單個核細胞HCMV-DNA陽性率高于尿液HCMV-DNA和血清HCMV-IgM陽性率，差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示在新生兒疑似感染中同時檢測其母乳及外周血單個核細胞HCMV-DNA含量可提高檢出率，幫助早期診斷。HCMV最易侵犯腎臟等管道上皮細胞，并可在腎小球和腎小管上皮細胞內(nèi)復(fù)制，隨尿液排出，因此可在尿液中檢測HCMV-DNA[11]。在嬰兒組中，尿液HCMV-DNA陽性率最高，顯著高于新生兒組，P＜0.01，這可能是與嬰兒組相比，新生兒腎臟濃縮功能還不健全，尿液中病毒被稀釋導(dǎo)致病毒含量非常低[12，13]，但具體機制還需進一步的研究。由此看來，在嬰兒疑似感染HCMV中，聯(lián)合檢測母乳和嬰兒尿液HCMV-DNA更有利于早期診斷。此研究為臨床提供了參考，可根據(jù)疑似患兒的年齡選擇送檢標本，以提高檢出率，達到早診斷早治療的目的。

由于母乳營養(yǎng)成分全面且含豐富的免疫成分，適合小兒生長發(fā)育的需要并能降低嬰兒感染感染性疾病的發(fā)生率。因此，母乳喂養(yǎng)一直被大力提倡。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)是導(dǎo)致嬰幼兒巨細胞病毒感染的流行病學(xué)的主要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，母乳HCMV-DNA陽性率與尿液、單個核細胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM陽性率均呈顯著性正相關(guān)（表2），與國內(nèi)報道基本一致[15]，提示患兒感染HCMV與母乳傳播關(guān)系密切，證實了小兒HCMV感染可能來自母親，提高孕婦孕產(chǎn)前的HCMV檢查顯得十分重要。

不同標本、不同檢測方法均可對HCMV陽性結(jié)果造成影響。如表2所示，在母乳HCMV-DNA陽性的情況下，患兒尿液、單個核細胞HCMVDNA和血清HCMV-IgM均存在一定的陰性比例。其中，尿液HCMV-DNA假陰性可能與HCMV尿液間歇性排毒有關(guān)[16]，處于不排毒狀態(tài)時檢測的標本會產(chǎn)生與臨床診斷不符合的現(xiàn)象，因此需反復(fù)、連續(xù)、多次檢查尿液HCMV-DNA，以提高檢出率。另外，人體感染HCMV后3～5d即可出現(xiàn)HCMVIgM抗體，其陽性是診斷早期感染的可靠指標，并表明為活動性感染，但HCMV-IgM抗體在血液僅存在3～6個月，臨床實驗室檢測陽性率較低，并且由于免疫抑制效應(yīng)，機體的免疫功能低下，新生兒和嬰兒產(chǎn)生HCMV-IgM的能力較弱，導(dǎo)至出現(xiàn)假陰性。此外，類風(fēng)濕因子、既往感染的殘留和皰疹病毒屬交叉反應(yīng)均能造成假陽性，因此單一的HCMV-IgM指標對診斷HCMV感染并不可靠。聯(lián)合母乳、尿液、單個核細胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM檢測有助于患兒HCMV感染的輔助診斷。

綜上所述，若患兒標本不易留取，應(yīng)優(yōu)先選擇檢出率高的標本，若條件允許，應(yīng)同時留取血液、尿液及患兒母親的乳汁，以提高HCMV的檢出率，防止漏診，以便及時給予抗病毒治療，對降低疾病的嚴重性和死亡率至關(guān)重要。

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R373.9，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0340-04

謝康，男，1982年生，學(xué)士學(xué)位，主管技師，醫(yī)學(xué)檢驗/分子遺傳學(xué)專業(yè)，主要從事人巨細胞病毒臨床基因擴增檢測、地中海貧血基因檢測及產(chǎn)前診斷、Y染色體微缺失、SRY基因檢測等研究工作。

劉艷秋，女，1964年生，教授，主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷等研究工作。E-mail：ragexp@126.com核細胞層于離心管中，12000r/min離心5min，取沉淀。促凝管標本：于3000r/min離心5min，取血清。

2016-09-28；

2017-04-03)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.014