王志杰+郭曉玲+劉海英+王天儀+李煥龍+張錚+周搏+門(mén)秀麗

【摘要】 目的 從微小RNA（microRNA）組學(xué)角度探索兒童急性橫貫性脊髓炎（ATM）發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制， 以期尋找關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。方法 使用microarray4.0芯片檢測(cè)兒童急性橫貫性脊髓炎患兒腦脊液中發(fā)生改變的microRNA， 運(yùn)用生物信息學(xué)方法論證發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的microRNA， 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)進(jìn)行生物學(xué)與技術(shù)重復(fù)。檢測(cè)關(guān)鍵microRNA靶蛋白的表達(dá)量并分析樣本間靶蛋白與目標(biāo)microRNA表達(dá)變化趨勢(shì)相關(guān)性。結(jié)果 急性橫貫性脊髓炎患兒腦脊液樣本中共有247個(gè)microRNA發(fā)生表達(dá)變化， microRNA-182-5p（miR-182-5p）特征性上調(diào)明顯。生物信息分析結(jié)果顯示cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 （CREB）可為miR-182-5p的靶基因， 與miR-182-5p趨勢(shì)相反。結(jié)論 兒童急性橫貫性脊髓炎腦脊液中miR-182-5p上調(diào)導(dǎo)致CREB下調(diào)， 使神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)能力下降。miR-182-5p是兒童急性橫貫性脊髓炎治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。

【關(guān)鍵詞】 兒童急性橫貫性脊髓炎；腦脊液；微小RNA；cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 ；治療靶點(diǎn)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.16.029

急性橫貫性脊髓炎（acute transverse myelitis， ATM）屬于橫貫性脊髓炎（transverse myelitis， TM）疾病的炎癥亞型。在急性期與亞急性期可以損傷脊髓產(chǎn)生臨床癥狀， 進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能的缺陷。至今為止絕大部分急性橫貫性脊髓炎患兒的發(fā)病機(jī)制依然難以明確， 兒童時(shí)期是急性橫貫性脊髓炎患兒發(fā)病率較高的兩個(gè)階段之一。cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 （cAMP response element binding protein， CREB）與學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)退行性疾病以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、維持突觸功能和促進(jìn)再生有關(guān)[1-3]。有學(xué)者報(bào)道， 神經(jīng)細(xì)胞中CREB的表達(dá)能克服髓磷脂抑制促進(jìn)損傷的脊髓后索再生[4-6]。本研究首先應(yīng)用microarray方法在microRNA組學(xué)（miRNomes）角度觀察急性橫貫性脊髓炎樣本中microRNA的表達(dá)改變， 進(jìn)而尋找關(guān)鍵microRNA以及它的靶基因、靶蛋白。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集 本研究收錄承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、中國(guó)人民解放軍第二六六醫(yī)院2016年1～9月診斷為急性橫貫性脊髓炎的4例患兒， 家屬簽署知情同意書(shū)后， 取腦脊液樣本隨機(jī)編號(hào)為T(mén)1～T4凍存。對(duì)照組腦脊液樣本來(lái)自臨床懷疑相關(guān)疾病， 經(jīng)腦脊液等相關(guān)檢查排除疾病， 腦脊液為正常者3例患兒， 家屬簽署知情同意書(shū)后， 取腦脊液樣本凍存。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①ATM組：按照TMCWG診斷標(biāo)準(zhǔn)（橫貫性脊髓炎聯(lián)盟工作組織于2002年提出的公共診斷標(biāo)準(zhǔn)）診斷為ATM者， 且無(wú)其他疾病。②對(duì)照組：臨床懷疑相關(guān)疾病， 經(jīng)腦脊液等相關(guān)檢查排除疾病， 腦脊液為正常者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有遺傳性疾病家族史者；近期曾患感染性疾病者；營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)欠佳者；有結(jié)核病史者。

1. 2 總RNA抽提 采用mirVanaTM PARISTM Kit試劑盒（Ambion， 美國(guó)）按照說(shuō)明書(shū)操作， 具體如下：每例樣本采集腦脊液2 ml， 迅速轉(zhuǎn)入抗凝管中用移液器混勻。在1 h內(nèi)（室溫條件下）進(jìn)行下面的操作：820 g， 4℃， 離心10 min。吸取1 ml上清轉(zhuǎn)至干凈的1.5 ml離心管中， 16000 g， 4℃， 離心10 min。小心吸取上清到新的離心管中， 置于-80℃保存?zhèn)溆?。取適量的樣本400 ?l， 加入等量的2×Denaturing Solution， 渦旋混勻， 冰上放置5 min。加入等體積的氯仿， 渦旋混勻30～60 s， 室溫， 最高轉(zhuǎn)速離心5 min。小心吸取上清到新的1.5 ml離心管中， 添加1.25倍體積的無(wú)水乙醇， 渦旋混勻。轉(zhuǎn)移至柱子中（最大體積700 ?l），13000 g， 離心30 s。加入350 ?l microRNA Wash Solution 1到離心柱中， 13000 g， 室溫離心15 s， 棄流過(guò)液， 將離心柱重新放置到收集管中?；旌?0 ?l DNase I和 70 ?l Buffer RDD QIAGEN總體積80 ?l， 加到離心柱中的膜上， 室溫放置15 min。加入350 ?l microRNA Wash Solution 1到離心柱中， 13000 g， 室溫離心15 s， 棄流過(guò)液， 將離心柱重新放置到收集管中。加入500 ?l Wash Solution 2/3過(guò)柱2次， 空柱離心1 min。將離心柱放置到新的收集管中， 柱中心加100 ?l 95℃預(yù)熱的Elution Solution， 室溫最高轉(zhuǎn)速離心20～30 s， 收集管中的液體即為提取的Total RNA， 放置在-70℃保存。

1. 3 microRNA表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用microRNA 4.0芯片（Affymetrix， 美國(guó)）。利用NanoDrop ND-2100（Thermo Scientific， 美國(guó)）定量總RNA并用Agilent 2100（Agilent， 美國(guó)）檢測(cè)RNA完整性。質(zhì)檢合格后， 參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫。利用Affymetrix Scanner 3000（Affymetrix， 美國(guó)）掃描得到原始圖像。應(yīng)用Expression Console version1.3.1（Affymetrix， 美國(guó)）數(shù)據(jù)分析軟件分析圖像， 將所得原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為RMA標(biāo)準(zhǔn)化算法信號(hào)值， 并應(yīng)用分層聚類分析的方法對(duì)樣本間microRNA表達(dá)模式進(jìn)行分析。

1. 4 RT-qPCR 利用miScript II Reverse Transcription Kit （Qiagen， 德國(guó)） 和PrimerScript RT reagent Kit （TaKaRa， 日本）分別進(jìn)行microRNA和mRNA的檢測(cè)。分別用U6 和 GADPH對(duì)所得的microRNA和mRNA表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1. 5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA） 采用美國(guó)R&D System公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)， 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2. 1 兒童急性橫貫性脊髓炎microRNA表達(dá)譜分析 芯片結(jié)果顯示， 與對(duì)照組相比急性橫貫性脊髓炎樣本中共有247個(gè)microRNA發(fā)生表達(dá)變化（見(jiàn)圖1）。其中miR-182-5p在各樣本中明顯上調(diào)， 與對(duì)照組相比分別上調(diào)3.61、5.93、4.28及3.74倍， 這4個(gè)上調(diào)倍數(shù)在各樣本上調(diào)倍數(shù)排序中分別位于第5、4、7、6位。這就使得miR-182-5p初步納入研究者的視線。用RT-qPCR驗(yàn)證芯片miR-182-5p相關(guān)數(shù)據(jù)， 結(jié)果顯示具有良好的一致性（見(jiàn)圖2）。

2. 2 靶基因預(yù)測(cè) 為了進(jìn)一步研究miR-182-5p表達(dá)變化的意義， 本研究應(yīng)用Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-182-5p的靶基因， 并查詢相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其靶基因可為CREB（見(jiàn)表1）。

2. 3 CREB蛋白的表達(dá)量與變化趨勢(shì) 用ELISA檢測(cè)各樣本CREB蛋白的表達(dá)量（見(jiàn)表2）， 比較發(fā)現(xiàn)CREB蛋白與miR-182-5p的表達(dá)趨勢(shì)相反（見(jiàn)圖3）。進(jìn)一步說(shuō)明了CREB是miR-182-5p的靶基因。

3 討論

miR-182-5p上調(diào)是影響急性橫貫性脊髓炎臨床特點(diǎn)的重要因素之一；miR-182-5p通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因CREB從而進(jìn)一步影響神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)。急性橫貫性脊髓炎樣本中， 至少發(fā)生一次改變的microRNA一共有247個(gè)， 經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息分析這些microRNA涉及多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7-9]。miR-182-5p只是諸多發(fā)揮調(diào)控作用的重要microRNA之一。本團(tuán)隊(duì)期待在未來(lái)實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步探索其他關(guān)鍵調(diào)控microRNA以期更客觀、全面、深入探究急性橫貫性脊髓炎發(fā)病機(jī)理， 為臨床應(yīng)用找到更多且更加有效的治療靶點(diǎn)。

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