單 珊，李曉明，周晨陽，苗玉花

·基礎研究·

p27及HIF-1α在二甲雙胍調節(jié)下咽癌細胞增殖與凋亡中的作用研究

單 珊，李曉明，周晨陽，苗玉花

目的 探討二甲雙胍在下咽癌細胞增殖與凋亡中的作用，以及p27和缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)蛋白在該調節(jié)機制中的作用，為臨床治療下咽癌提供進一步的理論基礎。方法 以0、5、10 mmol/L二甲雙胍干預體外培養(yǎng)人下咽癌Fadu細胞24 h，5 mmol/L組再干預至48 h，應用免疫細胞化學法檢測p27和HIF-1α蛋白的表達。下咽癌移植瘤裸鼠隨機分為對照組(不予二甲雙胍干預)，低劑量二甲雙胍治療組(met 40組，每日40 mg/kg)，高劑量二甲雙胍治療組(met 200組，每日200 mg/kg)，各5只，腹腔注射給藥28 d后，取移植瘤測量腫瘤體積，計算抑瘤率； HE染色觀察腫瘤細胞形態(tài)，免疫組織化學染色法檢測p27和HIF-1α蛋白表達水平的變化。結果 體外培養(yǎng)的Fadu細胞p27蛋白表達隨二甲雙胍干預濃度的增加及干預時間的延長而增加(P均<0.05)，而HIF-1α蛋白表達隨二甲雙胍干預濃度的增加及干預時間的延長而降低(P均<0.05)。下咽癌移植瘤裸鼠藥物干預后，met 40組和met 200組移植瘤體積均較對照組縮小(P均<0.05)；移植瘤標本p27蛋白表達隨給藥濃度的增加而增加，HIF-1α蛋白表達隨給藥濃度增加而降低(P均<0.05)。結論 二甲雙胍可有效抑制下咽癌細胞體內、體外的增殖并促進其凋亡，為臨床治療下咽癌提供進一步的理論依據(jù)。

二甲雙胍；下咽腫瘤；Fadu細胞；p27；HIF-1α；細胞增殖；細胞凋亡

自Evans等[1]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著降低糖尿病患者的腫瘤風險后，近十多年開展了大量關于二甲雙胍抗腫瘤效應的研究。多項關于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤類型的體內外實驗研究已經證實，二甲雙胍確實存在抗腫瘤的生物學特性[2-3]。而且一些研究也已證實二甲雙胍具有抑制腫瘤細胞蛋白合成、阻滯細胞周期發(fā)展、抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡的功能[4]。但下咽癌相關研究卻鮮見報道。p27基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的抑癌基因，其編碼的p27蛋白為細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，可負性調控細胞周期[5-9]。另有研究表明，二甲雙胍可減少腫瘤細胞氧的消耗，經轉錄及轉錄后機制抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)的聚集，使HIF-1α的表達量減少，降低腫瘤的發(fā)生率[10]。本實驗的目的是通過體內、體外實驗，研究p27、HIF-1α在二甲雙胍調節(jié)下咽癌細胞增殖與凋亡中的作用，為臨床治療下咽癌提供進一步的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物 Fadu人下咽癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，特級胎牛血清購自以色列BI公司，二甲雙胍購自中國藥品生物制品鑒定所，兔抗p27多克隆抗體、兔抗HIF-1α多克隆抗體購自中國Affinity公司。雄性4周齡BALB/c Nude SPF小鼠22只，體重19～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK(京)2012-0001，使用許可證號為SYXK(軍)2013-0002。

1.2 實驗方法

1.2.1 二甲雙胍對Fadu細胞p27及HIF-1α蛋白的表達：制備細胞爬片，細胞貼壁生長后，以含0、5、10 mmol/L二甲雙胍的培養(yǎng)基(對照組、5 mmol/L組、10 mmol/L組)培養(yǎng)細胞至24 h，5 mmol/L組再干預至48 h，取出玻片應用免疫細胞化學法行SP染色檢測p27及HIF-1α表達情況。光學顯微鏡采集圖像，光密度圖像分析儀分析平均光密度。

1.2.2 構建下咽癌裸鼠皮下移植瘤模型：①構建荷瘤鼠：將混懸均勻的人下咽癌細胞株Fadu細胞懸液注射于裸鼠右側腋背部皮下，每只注射0.2 ml，約(2～4)×107個細胞，共接種2只。接種7 d左右，接種部位皮下可觸及小米粒大小硬結；接種2周后移植瘤直徑約為1.5 cm。②構建移植瘤模型：脫頸處死荷瘤鼠，剖出瘤塊，剪碎成體積為1 mm3左右的瘤塊，于裸鼠背部偏右側皮膚剪一V型小口，將剪好的小瘤塊自小口塞入皮下，并于皮下推至右側腋背部，分籠飼養(yǎng)。

1.2.3 裸鼠分組：將接種瘤塊的20只裸鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6或7只，觀察成瘤情況。每日測量腫瘤的長、短徑，計算腫瘤體積(體積=π/6×A×B2，A為長徑，B為短徑，π/6≈0.52)[11]。待移植瘤長至約60 mm3時，選取15只瘤塊較均勻的裸鼠，隨機均分為對照組(不給予二甲雙胍)、低劑量二甲雙胍治療組(met 40組，每日40 mg/kg)和高劑量二甲雙胍治療組(met 200組，每日200 mg/kg)。

1.2.4 二甲雙胍干預及觀察抑瘤率：采用腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)注射28 d。開始藥物干預后，每日觀察裸鼠的一般情況(精神、飲食、活動、二便、皮膚、毛發(fā)等)，每4 d測量裸鼠的體重，測量移植瘤長、短徑并計算腫瘤體積。干預結束時留取腫瘤組織測量腫瘤體積，計算藥物抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%[11]。

1.2.5 細胞形態(tài)學觀察：取移植瘤石蠟標本后切片，采用蘇木素-伊紅染色法觀察凋亡細胞的形態(tài)學特征。

1.2.6 腫瘤組織目的蛋白的表達：應用免疫組織化學染色檢測腫瘤組織目的蛋白表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化，抗原熱修復，滴加一抗、二抗，置于VECTASTAIN ABC反應液中，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。光學顯微鏡下采集圖像，胞核或胞漿呈棕黃色者為陽性，光密度圖像分析儀分析平均光密度，用平均光密度值量化蛋白表達強度，平均光密度值越大表示蛋白表達越強。

2 結果

2.1 二甲雙胍對下咽癌Fadu細胞體外增殖的作用 人下咽癌Fadu細胞p27蛋白表達定位于胞核，HIF-1α蛋白在胞核和胞漿中均有表達(圖1)；p27蛋白表達0 mmol/L組為0.150±0.025，5 mmol/L組干預24 h時為0.167±0.025、干預48 h時為0.192±0.035，10 mmol/L組干預24 h時為0.275±0.06；HIF-1α蛋白表達對照組為0.252±0.087，5 mmol/L組干預24 h時為0.213±0.060、干預48 h時為0.181±0.037，10 mmol/L組干預24 h時為0.160±0.032。見圖2。在二甲雙胍干預下，人下咽癌Fadu細胞p27蛋白表達明顯升高，而HIF-1α蛋白表達明顯降低，且呈濃度-時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

圖1 二甲雙胍作用Fadu細胞p27蛋白及缺氧誘導因子-1α蛋白免疫細胞化學染色所示(SP×200)a.5 mmol/L組干預24 h；b.10 mmol/L組干預24 h；c.5 mmol/L組干預48 h；d.未干預；1.p27蛋白，2.缺氧誘導因子-1α

圖2 二甲雙胍作用Fadu細胞p27蛋白及缺氧誘導因子-1α蛋白表達與對照組比較，aP<0.05

2.2 二甲雙胍對下咽癌移植瘤生長的影響 藥物干預結束時對照組腫瘤體積為(488.76±37.29)mm3，met 40組腫瘤體積為(374.86±42.16)mm3、抑瘤率為(23.30±7.17)%，met 200組腫瘤體積為(290.77±25.34)mm3、抑瘤率為(40.51±9.25)%。見圖3。與對照組相比，met 40組和met 200組腫瘤體積均顯著被抑制，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示二甲雙胍可以抑制下咽癌裸鼠移植瘤的生長。

圖3 二甲雙胍對下咽癌移植瘤生長的影響

a.未干預組；b.每日40 mg/kg干預組；c.每日200 mg/kg干預組

2.3 移植瘤組織形態(tài)學特征 移植瘤細胞大小、形態(tài)不一，有明顯異型性，核大深染，核仁明顯，可見核分裂象，細胞形狀不規(guī)則，呈巢狀、團塊狀或條索狀密集排列，以少量間質間隔。腫瘤組織內可見均勻染色片狀分布的粉紅色壞死區(qū)域。met 40組、met 200組及對照組移植瘤細胞形態(tài)無差異，見圖4。

圖4 下咽癌裸鼠移植瘤組織形態(tài)學特征(HE染色)a.未干預組×100；b.未干預組×400；c.每日40 mg/kg干預組×400；d.每日200 mg/kg干預組×400

2.4 p27、HIF-1α在二甲雙胍誘導下咽癌細胞凋亡中的作用 免疫組織化學染色結果顯示，p27蛋白在腫瘤細胞胞核中表達，HIF-1α蛋白在胞核和胞漿中均有表達。見圖5。p27蛋白表達對照組為0.281±0.056，met 40組為0.340±0.103，met 200組為0.421±0.085；HIF-1α蛋白對照組為0.308±0.052，met 40組為0.275±0.048，met 200組為0.226±0.047。結果顯示：p27蛋白表達隨給藥濃度增加而增加，HIF-1α蛋白表達隨給藥濃度增加而降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖6。

圖5 二甲雙胍干預下咽癌移植瘤p27蛋白及缺氧誘導因子-1α蛋白免疫組織化學染色(×400)a.未干預組，b.每日40 mg/kg干預組，c.每日200 mg/kg干預組；1.p27蛋白，2.缺氧誘導因子-1α

圖6 二甲雙胍干預下咽癌移植瘤p27蛋白及缺氧誘導因子-1α蛋白表達

對照組為未干預組，met 40組為每日40 mg/kg干預組，met 200組為每日200 mg/kg干預組；與對照組比較，aP<0.05

3 討論

本課題組前期對下咽癌細胞體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過阻滯細胞周期循環(huán)和誘導細胞凋亡抑制下咽癌細胞增殖[12]。研究中我們發(fā)現(xiàn)，下咽癌Fadu細胞經二甲雙胍處理后呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學變化[12]，與此同時經二甲雙胍處理后的移植瘤同樣呈現(xiàn)生長抑制狀態(tài)，而這些變化與藥物濃度及作用時間呈正相關[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞周期的一系列調節(jié)因子中，只有G1期的調節(jié)因子出現(xiàn)改變或突變進而引起細胞增殖的不可控性，才可能導致腫瘤的發(fā)生[14]。我們的前期實驗研究已經證實，二甲雙胍干預Fadu細胞后細胞周期被阻滯于G1期,結合前期研究及有關細胞凋亡研究的現(xiàn)狀，我們推測p27及HIF-1α蛋白參與了二甲雙胍介導的下咽癌細胞的增殖與凋亡過程。故本實驗我們分別通過干預體外下咽癌Fadu細胞及體內裸鼠移植瘤，并應用免疫細胞化學和免疫組織化學的檢測方法，進而從基因轉錄水平證實二甲雙胍的調控機制與p27及HIF-1α表達的相關性。

本課題組前期研究分別從體外和體內實驗檢測了二甲雙胍可以將瘤細胞阻滯于G1期，至少部分通過AMPK-p53-p21、cyclinD1相關的信號傳導通路發(fā)揮對下咽癌細胞的增殖抑制作用，提示二甲雙胍可以通過對AMPK、p21的正性調控及對cyclinD1的負性調控作用，抑制下咽癌細胞的增殖[12-13]。p27與p21同為p53下游的相關周期調控蛋白[15-16]，而cyclinD1/CDK復合物的功能之一即是連接或隔離p27，從而防止p27阻斷cyclinD1/CDK復合物的形成，使瘤細胞可從G0/G1期順利進入S期，即推測隨cyclinD1被抑制，減少對p27的阻斷，可以阻滯瘤細胞向S期轉化[17]。p27可以阻止一系列啟動細胞向S期轉化必需的靶分子磷酸化，從而抑制細胞G1期相關CYC-CDK復合物及CYCB-CDC2復合物的合成，其過表達可誘導細胞G1/S期阻滯[18],而其表達下降可降低對正性調控細胞周期蛋白的抑制作用，致細胞過度增殖乃至腫瘤形成[19]。本實驗無論是體內還是體外實驗，均發(fā)現(xiàn)在二甲雙胍干預下p27蛋白表達顯著上調，說明二甲雙胍可通過上調抑癌基因p27蛋白表達水平，調控細胞周期、抑制細胞分裂，最終抑制腫瘤生長。

另外，眾多實驗研究證實，絕大部分實體腫瘤內部為缺氧微環(huán)境，細胞缺氧應答的關鍵環(huán)節(jié)是HIF-1α的活化，活化的HIF-1α參與調控多種靶基因的轉錄，影響腫瘤細胞的能量代謝及增殖和凋亡，進而使腫瘤細胞產生一系列反應適應缺氧環(huán)境，促進腫瘤血管生成，增強腫瘤的侵襲性及放化療抵抗[20]。二甲雙胍可以通過降低腫瘤細胞氧耗，抑制HIF-1α的聚集[21]，并作用于HIF-1α上游相關信號傳導通路(AMPK-mTOR-HIF-1α通路)，激活AMPK及上調DICER的表達，抑制HIF-1α的合成，使HIF-1α的表達量減少，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制HIF-1α的表達，進而抑制腫瘤生長。

目前研究提示，二甲雙胍可抑制線粒體復合體I活性、降低氧耗，降低HIF-1α表達水平，抑制腫瘤細胞生長及提高腫瘤對放化療敏感性[22]。同時我們前期實驗也已證實，二甲雙胍可增強順鉑及紫杉醇的藥物敏感性[12]。故在后期研究中，我們可在本實驗的基礎上進一步聯(lián)合應用化療藥物，探索二甲雙胍的化療增敏作用，為臨床單獨應用二甲雙胍及聯(lián)合化療藥物治療下咽癌提供更多的理論基礎。

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Effects of p27 and HIF-1α on Metformin Impacting Proliferation and Apoptosis of Hypopharyngeal Carcinoma Cells

SHAN Shan1, LI Xiao-ming1, ZHOU Chen-yang2, MIAO Yu-hua1

( 1. PLA Bethune International Peace Hospital ENT, Shi Jiazhuang 050082, China; 2. PLA 401 Hospital ENT, Qingdao 266071, China)

Objective To investigate the effects of metformin on cell proliferation and apoptosis in human hypopharyngeal carcinoma cells in vitro and in vivo, and to observe the mechanism of p27 and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) in above, we can explore the theoretical basis of metformin for the clinical treatment. Methods Fadu cells in vitro were treated with different concentrations(0、5、10 mmol/L) metformin for 24 h, and with 5 mmol/L medicine for 48 h, to examine the expressions of p27 and HIF-1α by immunocytochemistry. The hypopharyngeal carcinoma xenografts in nude mice model were randomized into control group, low-dose metformin treatment group ( met 40 group, daily 40 mg/kg) and high-dose metformin treatment group ( met 200 group, daily 200 mg/kg). 28 days treatment by intraperitoneal injection later, we collect the tumor, measure their volume, calculate tumor inhibition ratio and observe the tumor morphology by HE. Then the tumors were used for immunohistochemical analyses to detect p27 and HIF-1α. Results Compared with the control group, the expressions of p27 were higher in the hypopharyngeal carcinoma cell in vitro by metformin dose-and-time dependent (P<0.05), nevertheless, the expressions of HIF-1αwere lower(P<0.05). The average volumes of hypopharyngeal carcinoma xenografts of the two metformin treated groups were significantly low compared with that of the control group. And the expressions of p27 were higher and of the HIF-1α were lower than those in cells untreated with metformin(P<0.05). Conclusion Metformin can inhibit the growth and promote apoptosis of hypopharyngeal carcinoma cell in vitro and in vivo effectively, to provide the basis for the clinical treatment of hypopharyngeal carcinoma.

Metformin; Hypopharyngeal neoplasms; Fadu cell; p27; HIF-1α； Cell proliferation; Apoptosis

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目(1120140041)

050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(單珊、李曉明、苗玉花)；266071 青島，解放軍401醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(周晨陽)

李曉明，E-mail:xmlmo@126.com

R-332；R977.15

A

1002-3429(2017)04-0094-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.04.034

2016-11-08 修回時間：2017-01-03)