劉勇軍，熊學(xué)武，巢燕芳，楊鐵金

(1 齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2 東陽光藥物研究院，廣東東莞 443300)

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氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定奧美沙坦酯中基因毒性雜質(zhì)4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮

劉勇軍1，2，熊學(xué)武2，巢燕芳2，楊鐵金1

(1 齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2 東陽光藥物研究院，廣東東莞 443300)

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法，測(cè)定奧美沙坦酯原料藥中基毒雜質(zhì)4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮 (4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-one，DMDO-Cl)。選用4，5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮(DMDO)為內(nèi)標(biāo)物，奧美沙坦酯原料藥經(jīng)1%甲酸的二氯甲烷溶解后，加入正庚烷使奧美沙坦酯析出。取上述清液，用DB-624色譜柱(30m×0.32mm×1.8μm)分離，使用氦氣為載氣，流速2mL/min，分流比1∶1，程序升溫模式，進(jìn)行測(cè)定。用電子轟擊(EI)質(zhì)譜，在離子選擇(SIM)模式下，監(jiān)控m/z113與m/z114離子進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定痕量DMDO-Cl。研究記過表明，該檢查方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。

奧美沙坦酯，基因毒性雜質(zhì)，氣質(zhì)聯(lián)用，雜質(zhì)痕量檢測(cè)

奧美沙坦酯(Olmesartan medoxomil)是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物[1]，主要用于高血壓的治療。該藥物由日本Sankyo (三共公司)和美國Forestlaboratories共同開發(fā)，于2002年在美國上市。相對(duì)同類降壓藥，具有劑量小、起效快、半衰期長、不良反應(yīng)率低等明顯優(yōu)點(diǎn)。4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮(DMDO-Cl)是奧美沙坦酯合成中用到的一個(gè)關(guān)鍵起始物料，含有一級(jí)鹵代烷基結(jié)構(gòu)，屬于潛在基因毒性雜質(zhì)[2]。因其通常用于工藝的最后步驟[3-4]，較難被降低到毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC，Threshold of Toxicological Concern)限度以下?；仡櫧鼛啄陣鴥?nèi)外藥政法規(guī)動(dòng)向，各主要規(guī)范市場(中國、美國、歐盟)官方對(duì)于藥物中潛在基因毒性雜質(zhì)的要求越來越嚴(yán)格，要求建立方法控制藥物中的潛在基因毒性雜質(zhì)，限度為不超過1.5μg/day[5-6]。結(jié)合奧美沙坦酯的最大日劑量40mg/day，樣品中DMDO-Cl含量不得超過37.5mg/kg。

DMDO-Cl是一種淺黃色透明油性液體，可通過向藥物分子中引入甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-2-酮結(jié)構(gòu)單元，使藥物分子的生物利用度大為提高[7-8]，故被廣泛用于制藥業(yè)(如阿齊沙坦酯鉀[9]等的合成)。文獻(xiàn)有報(bào)道采用氣相色譜(GC)配火焰離子檢測(cè)器(FID)的方法測(cè)定DMDO-Cl含量[10]，但是方法的基質(zhì)效應(yīng)影響大，靈敏度低，不適用于痕量檢測(cè)。對(duì)于痕量雜質(zhì)的檢測(cè)，通?；诨衔镄再|(zhì)，選擇液相或者氣相進(jìn)行分離。如果采用氣相色譜，常用的檢測(cè)器通常為電子碰撞(EI)或化學(xué)電離(CI)質(zhì)譜，也可采用對(duì)鹵素原子具有選擇性的離子俘獲檢測(cè)器(ECD)[11-13]。

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定奧美沙坦酯中的DMDO-Cl。該方法過程包括通過沉淀法[14]，最大程度降低基質(zhì)效應(yīng)；再選用4，5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮為內(nèi)標(biāo)物，減少色譜進(jìn)樣量和儀器的波動(dòng)；最后使用質(zhì)譜作為定量手段，提高靈敏度。研究結(jié)果表明，故該方法具有基質(zhì)效應(yīng)低、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點(diǎn)，對(duì)DMDO-Cl在其他藥物中的檢測(cè)具有借鑒意義。

1 DMDO-Cl制備

1.1 合成路線

圖1 DMDO-Cl合成路線圖Fig.1 Synthetic Route of DMDO-Cl

1.2 提純過程

將羥基丁酮溶于甲苯，并加入催化量三乙胺。隨后滴加三光氣的二氯甲烷溶液。攪拌使反應(yīng)完成。所得產(chǎn)物水洗，干燥，用異丙醚重結(jié)晶，得到DMDO。將DMDO溶于二氯甲烷，滴加二氯亞砜，冰浴攪拌促使反應(yīng)完成，得到DMDO-Cl。

2 分析檢查

2.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配EI離子源，美國Agilent Technologies 公司)；梅特勒XPE-205DR電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；二氯甲烷(色譜純，美國Spectrum公司)；正庚烷(色譜純，科魯?shù)禄す煞萦邢薰?；甲酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；4，5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮(DMDO，內(nèi)標(biāo)物，上海Accela公司，含量97%)；DMDO-Cl標(biāo)準(zhǔn)品(東莞東陽光藥物研發(fā)有限公司標(biāo)定，含量88.2%)；奧美沙坦酯原料藥(API，廣東東莞東陽光藥物研發(fā)有限公司，含量99.8%)。

2.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液配制

取DMDO，加二氯甲烷稀釋至0.095mg/mL。移取10mL上述溶液至500mL容量瓶，加5mL甲酸，用二氯甲烷稀釋定容得到內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(濃度1.9μg/mL)。

2.3 對(duì)照溶液配制

取DMDO-Cl約59mg，加內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋至1.9μg/mL得到對(duì)照儲(chǔ)備液。移取2mL上述溶液至10mL容量瓶，加正庚烷稀釋定容得到對(duì)照溶液(濃度0.38μg/mL)。

2.4 樣品溶液配制

樣品溶液：取奧美沙坦酯API約100mg，至10mL容量瓶，加入2.0mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液溶解，再加入正庚烷定容，搖勻，密封靜置7h，待奧美沙坦酯充分析出后，取上清液為樣品溶液(濃度：10mg/mL，含內(nèi)標(biāo)DMDO 0.38μg/mL)。

空白溶液：取2.0mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備，至10mL容量瓶，用正庚烷稀釋定容。

樣品加標(biāo)溶液配制(僅供專屬性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn))：稱取100mg樣品，置于10mL容量瓶中，加入2.0mL對(duì)照儲(chǔ)備液(1.9μg/mL)溶解，再加入正庚烷定容。搖勻，靜置7h。取上清液為樣品加標(biāo)溶液。

2.5 檢測(cè)條件

2.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-624(30m×0.32mm×1.8μm)；進(jìn)樣口溫度：180℃；載氣：氦氣；流速：2.0mL/min(恒流模式)；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：1∶1；爐溫：程序升溫模式(在60℃下保持3min，之后以20℃/min升溫至220℃，保持10min)；檢測(cè)器：火焰離子檢測(cè)器(FID)，溫度250℃；采樣頻率：20Hz。

2.5.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源(EI離子源)；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；MS傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：7.0min；電子倍增器模式：Gain factor；增益因子：1.0；MS掃描模式：離子選擇(SIM)；提取離子：7.0min～11.0min(m/z=114.0)，11.0min～21.0min(m/z=113.0)

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品溶液處理方式的選擇

奧美沙坦酯易溶于丙酮和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，溶于二氯甲烷，不溶于正庚烷；DMDO-Cl易溶于正庚烷。本實(shí)驗(yàn)嘗試了多種樣品處理方式，列舉三條代表性方式對(duì)比如下：

(1)取50mg樣品溶于5mL丙酮，所得溶液直接進(jìn)樣檢測(cè)：因主成分奧美沙坦酯影響雜質(zhì)DMDO-Cl出峰響應(yīng)，導(dǎo)致方法準(zhǔn)確度不合格。

(2)取100mg樣品溶于1.0mL DMF，隨后加入3.0mL超純水(降低DMDO-Cl在DMF中溶解度)，再加2.0mL正庚烷萃取。振搖1min，靜置2min，取上清液為供試液：因萃取回收率較差，導(dǎo)致重現(xiàn)性差。

(3)取100mg樣品溶于2.0mL含DMDO(1.9μg/mL)的1%甲酸-二氯甲烷溶液中，加入8mL正庚烷使奧美沙坦酯全部析出，取上清液為供試液：該方式通過加入1%甲酸助溶，使樣品完全溶于二氯甲烷，充分釋放其中的DMDO-Cl，隨后加入正庚烷，使奧美沙坦酯充分析出，降低基質(zhì)效應(yīng)，以提高回收率，獲得良好重現(xiàn)性和回收率。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

為降低氣相色譜進(jìn)樣和儀器穩(wěn)定性影響，選用結(jié)構(gòu)與DMDO-Cl接近，且不與樣品反應(yīng)，不干擾DMDO-Cl出峰的DMDO作為內(nèi)標(biāo)物。

3.3 裂解途徑

蔣介石在國民黨執(zhí)政的二十余年間，隨著個(gè)人權(quán)勢(shì)及外在環(huán)境的變化，不同時(shí)期對(duì)于黨義闡述的重點(diǎn)和指向會(huì)有不同，其宣導(dǎo)的對(duì)象亦在不斷擴(kuò)大，但隨著國民黨在大陸失敗的臨近，其宣導(dǎo)的效果及實(shí)際影響的范圍不斷衰微。

DMDO-Cl在EI離子源作用下，裂解情況如下。選用(1)為待測(cè)離子，因其豐度高，基線噪音低。

3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性

取空白溶液、對(duì)照溶液、依法檢測(cè)。重復(fù)進(jìn)樣三針對(duì)照溶液，所得結(jié)果中DMDO-Cl相對(duì)DMDO的校正因子均值為1.17，三針RSD為1.0%，說明本法系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

3.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取空白溶液、對(duì)照溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液，依法測(cè)定。記錄SIM譜圖，分別見圖2。結(jié)果顯示空白溶液在離子選擇模式下無DMDO-Cl背景干擾，對(duì)照溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液中DMDO-Cl與相鄰峰分離度分別2.86、2.56、3.21，達(dá)到基線分離要求。

圖2 空白溶液(a)，對(duì)照溶液(b)，樣品溶液(c)，樣品加標(biāo)溶液(d)選擇離子檢測(cè)圖譜Fig.2 Chromatogram of Blank Solution (a)，Standard Solution (b) and Sample Solution (c) and Spiked solution (d)

3.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

平行配制6份樣品加標(biāo)溶液，并依法檢測(cè)。6次測(cè)定結(jié)果的RSD為1.77%，具有良好的重復(fù)性。

取不同量的DMDO-Cl，用內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋，得到一系列濃度(0.57μg/mL、0.944μg/mL、1.416μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL，對(duì)應(yīng) 11.2mg/kg、18.7mg/kg、28.1mg/kg、37.5mg/kg、56.2mg/kg)的DMDO-Cl線性溶液。測(cè)定該系列溶液，并計(jì)算DMDO-Cl與DMDO的峰面積比。分別以峰面積比(Y)對(duì)DMDO-Cl質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進(jìn)行回歸方程擬合。結(jié)果表明：在0.57μg/mL～2.832μg/mL(11.2mg/kg～56.2mg/kg，相當(dāng)于限度37.5mg/kg的30%～150%)濃度范圍內(nèi)，峰面積比值與濃度線性關(guān)系良好，線性方程為Y=2.308X-0.007(r=0.9997)。該方法最低定量濃度為0.57μg/mL(11.2mg/kg)。

3.8 加標(biāo)回收率及相對(duì)偏差

取樣品100mg，分別置于10mL容量瓶中，加入2.0mL DMDO-Cl線性溶液，濃度分別為0.57μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL(對(duì)應(yīng)限度的30%、100%、150%)，每個(gè)濃度平行配置三份，依法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，9份準(zhǔn)確度溶液中，DMDO-Cl的加標(biāo)回收率在94.1%～100.3%之間，回收率RSD為2.36%(見表1)。表明方法準(zhǔn)確度良好，能滿足檢測(cè)要求。

表1 奧美沙坦酯中DMDO-Cl的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Results of Recovery for DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil (n=9)

3.9 實(shí)際樣品分析

該研究對(duì)宜昌東陽光藥業(yè)送檢的幾個(gè)批次的樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，產(chǎn)品中DMDO-Cl雖有波動(dòng)(見表2)，但均低于TTC限度(37.5mg/kg)，符合藥政官方質(zhì)量要求。

表2 奧美沙坦酯中DMDO-Cl含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Content of DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil Drug Substance

4 結(jié)論

建立了一種通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，測(cè)定奧美沙坦酯中DMDO-Cl含量的新方法。研究結(jié)果表面，該檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，適合于痕量DMDO-Cl的檢測(cè)。

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Determination of Genotoxic Impurity of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone in Olmesartan Medoxomil using Gas Chromatograph-Mass Spectrometry (GC-MS) Method

LIU Yong-jun1，2，XIONG Xue-wu2，CHAO Yan-fang2，YANG Tie-jin2

(1 College of Chemistry and Chemical Engineering，Qiqihaer University，Heilongjiang Qiqihaer 161000，Heilongjiang，China；2 HEC Pharm Research and Development Institute，Dongguan 443300，Guangdong，China)

A gas chromatograph-mass spectrometric (GC-MS) method was developed for the determination of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone，which is classified as genotoxic impurity and may present in Olmesartan medoxomil drug substance (API) in trace level. The 4，5-dimethyl-1，3-dioxol-2-one (DMDO) is selected as internal standard. In order to avoid matrix interference，the Olmesartan medoxomil test sample was firstly dissolved in-dichloromethane (DCM) with the aid of 1% formic acid，then n-hexane was added to allow the Olmesartan medoxomil to precipitate completely. The supernatant obtained was injected into the DB-624 column (30m×0.32mm×1.8μm)，and separated by using helium as carrier gas at flow rate of 2mL/min and split ratio of 1∶1 under temperature programming mode. The detection of the DMDO-Cl was performed by mass spectrometry (MS) under Single Ion Monitoring (SIM) Mode. Selective ion monitors were set atm/z113 for DMDO-Cl andm/z114 for DMDO. The method was proved to be of good reproducibility，high sensitivity，accuracy and reliability.

Olmesartan medoxomil，genotoxic impurity，gas chromatograph-mass spectrometry，determination of Impurities at ppm Level

楊鐵金，學(xué)位，教授，研究方向：色譜分析，電化學(xué)分析；E-mail：tiejin99@126.com；Tel：0452-2742572

O 657

廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201604010105)