牛藝諾， 林寶英， 劉全鳳， 劉永震， 吳金山， 戎 偉， 梅雙雙*

(1.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院， 海南 儋州 571737； 2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， ?？?571001；3.滄州市農(nóng)林科學(xué)院， 河北 滄州 061001； 4.滄州市植物保護(hù)檢疫站， 河北 滄州 061000)

海南南繁基地玉米莖腐病病原菌的分離及鑒定

牛藝諾1， 林寶英2， 劉全鳳3， 劉永震4， 吳金山1， 戎 偉1， 梅雙雙1*

(1.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院， 海南 儋州 571737； 2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， ?？?571001；3.滄州市農(nóng)林科學(xué)院， 河北 滄州 061001； 4.滄州市植物保護(hù)檢疫站， 河北 滄州 061000)

為明確海南地區(qū)南繁基地玉米莖腐病的病原，從玉米發(fā)病組織中分離病原菌，并進(jìn)行了純化培養(yǎng)、革蘭氏染色、病原菌回接等試驗(yàn)，得到了2株對(duì)玉米有較強(qiáng)致病力的菌株，分別命名為JF02與JF04.隨后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增了所分離的玉米莖腐病病原菌JF02與JF04的16S rRNA序列，并測(cè)序，序列分析表明，所分離的玉米莖腐病病原菌序列相同，屬同一病原菌，且為狄克氏菌.該病原菌的分離和鑒定為玉米細(xì)菌性莖腐病的防治和抗性品種選育提供了一定的理論參考.

玉米莖腐??； 病原菌； 狄克氏菌

玉米是我國(guó)重要的糧食作物，栽培面積位居第一位.在玉米的生產(chǎn)過程中，玉米莖腐病是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的一種嚴(yán)重病害，主要表現(xiàn)為玉米根部和莖基部腐爛，最后引起玉米倒伏或整株枯死，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量.根據(jù)病原菌的不同，玉米莖腐病分為玉米真菌性莖腐病和玉米細(xì)菌性莖腐病.玉米真菌性莖腐病，又稱玉米青枯病，鐮孢菌是該病的主要病原菌[1-3].玉米真菌性莖腐病是一種毀滅性土傳病害，病原菌自根系侵入，在植株內(nèi)蔓延擴(kuò)展，最后病株根部，莖部出現(xiàn)空心、變軟，遇風(fēng)易倒伏，整個(gè)植株葉片自下而上失水變成青灰色并發(fā)生干枯，呈現(xiàn)青枯癥狀[4-5].玉米細(xì)菌性莖腐病是由胡蘿卜歐文氏菌玉米?；?Erwiniacarotovoraf.sp.zeae)引發(fā)的病害，該病原菌近期被命名為玉米狄克氏菌(Dickeyazeae)[6-8].玉米細(xì)菌性莖腐病癥狀主要表現(xiàn)為玉米中下部葉鞘和莖稈上出現(xiàn)不規(guī)則的水漬狀病斑，發(fā)病組織軟化、腐爛并散發(fā)出腥臭味，最后植株在發(fā)病部位折斷，導(dǎo)致玉米不能抽穗和或結(jié)實(shí)[9-11].

海南省地處熱帶北緣，冬季溫度高，適宜玉米種植.我國(guó)在海南三亞建立南繁基地，各農(nóng)業(yè)部門、大專院校和科研院所冬季在三亞進(jìn)行玉米品種選育、加代繁殖和雜交配置.在玉米種植的幼苗時(shí)期，玉米葉片為10多片葉時(shí)，玉米莖腐病是一種常見病害，高溫高濕環(huán)境下，該病發(fā)生更為嚴(yán)重，引起玉米倒伏和整株植物發(fā)生死亡，對(duì)玉米的種植帶來了嚴(yán)重的影響.但引發(fā)玉米莖腐病的病原菌目前仍是未知的.在本研究中，通過觀察南繁基地玉米莖腐病發(fā)病癥狀、以及進(jìn)行病原菌的分離和回接實(shí)驗(yàn)，證實(shí)南繁基地玉米莖腐病是細(xì)菌性莖腐病.另外，通過對(duì)病原菌16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)病原菌JF02和JF04實(shí)為玉米狄克氏菌.該研究為進(jìn)一步防治南繁基地的玉米莖腐病工作提供了一定的理論參考.

1材料和方法

1.1材料

1) 菌體：大腸桿菌DH 5α，本實(shí)驗(yàn)室保存.病原菌JF02、JF04，本實(shí)驗(yàn)室分離.

2) 玉米自交系：玉米自交系昌7-2.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離與純化 將玉米莖腐病發(fā)病部位用無菌水和70%的酒精進(jìn)行清洗，隨后用無菌手術(shù)剪截取發(fā)病組織2～3 cm的小段，部分小段放入PDA培養(yǎng)基.部分小段放入無菌研缽中加無菌水研磨，直至無明顯塊狀植物組織為止，將組織勻漿稀釋10倍和100倍，取20 μL涂布在LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1～2 d后，進(jìn)一步通過劃線得到單克隆病原菌[5].

1.2.2革蘭氏染色 將分離純化后的病原菌JF02培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后涂片固定，用草酸銨結(jié)晶紫染1 min，自來水沖洗，加革蘭氏碘液覆蓋涂面染約1 min，水洗，用吸水紙吸去水分，加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20 s后水洗，吸去水分.蕃紅染色液(稀)染1 min，自來水沖洗.干燥，顯微鏡鏡檢.

1.2.3生理生化鑒定 生理生化鑒定采用環(huán)凱細(xì)菌生化鑒定管.將分離純化后的病原菌JF02培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照說明書規(guī)定的接種方法，分別接種各生化鑒定管，28℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果.

1.2.4病原菌回接 將分離純化后的病原菌JF02 28℃培養(yǎng)過夜，4 000 rpm離心10 min，棄上清，用無菌去離子水懸浮菌體沉淀，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU/mL，用牙簽沾取菌液刺入玉米的莖部，同時(shí)用無菌水作對(duì)照，接種4～6 d后觀察發(fā)病情況.

1.2.5病原菌16S rRNA序列的測(cè)定 提取病原菌JF02基因組DNA，利用16S rRNA序列全長(zhǎng)通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，和1429R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[12]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將擴(kuò)增片段進(jìn)行回收，連入T載體進(jìn)行測(cè)序[2].

2結(jié)果與分析

2.1病原菌分離及回接實(shí)驗(yàn)

從海南省南繁基地采集的玉米莖腐病病樣組織(圖1)中分離純化培養(yǎng)出兩株細(xì)菌，命名為JF02和JF04.將病原菌JF02和JF04活化后，在28℃培養(yǎng)過夜后，調(diào)整菌液濃度至108CFU，利用針刺的方法接種玉米感病品種昌7-2，并接種無菌水作為對(duì)照.接種5 d后，JF02和JF04玉米接種植株從發(fā)病部位均呈現(xiàn)倒折狀態(tài)，對(duì)照接種水不發(fā)病.結(jié)果表明JF02和JF04是玉米細(xì)菌性莖腐病的病原菌.

圖1 田間玉米發(fā)病組織Fig.1 Maize stalk rot disease in wild field

圖2 病原菌JF02和JF04回接結(jié)果Fig.2 The bacteria strain JF02 and JF04 caused maize stalk rot disease

2.2病原菌16S rRNA 序列測(cè)定和分析

提取病原菌JF02和JF04全基因組DNA序列.利用細(xì)菌16S rRNA測(cè)定通用引物27F和1429R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序.結(jié)果表明JF02和JF04菌株16S rRNA序列完全相同，表明二者可能來源于同一菌株.進(jìn)一步通過Blast分析，發(fā)現(xiàn)二者序列與玉米狄克氏菌DickeyazeaeEC1同源性達(dá)到99%(圖3)，結(jié)果表明玉米莖腐病病原菌為玉米狄克氏菌.

2.3病原菌JF02生理生化鑒定結(jié)果

經(jīng)過革蘭氏染色，鏡檢，發(fā)現(xiàn)該菌株是一種革蘭氏染色陰性的球桿菌(圖4)，無芽孢.經(jīng)生理生化鑒定，該分離菌能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣；能分解甘露醇產(chǎn)酸，不能利用乳糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇；靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，MR試驗(yàn)陰性，VP試驗(yàn)陽(yáng)性，西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，尿素試驗(yàn)陰性，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性，丙二酸鹽試驗(yàn)陰性，苯丙氨酸試驗(yàn)陰性，鳥、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性.根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步將該分離菌鑒定為狄克氏菌屬.

圖3 JF02與Dickeya zeae EC1 16S rRNA比對(duì)結(jié)果Fig.3 The 16S rRNA difference between JF02 and Dickeya zeae EC1

圖4 JF02是革蘭氏陰性菌.Fig.4 JF02 is a gram-negative bacteria strain

3討論

玉米細(xì)菌性莖腐病具有傳染性強(qiáng)、高溫高濕環(huán)境下易暴發(fā)流行等特點(diǎn)，對(duì)玉米產(chǎn)量影響巨大.近年來，隨著玉米田病蟲害種類的不斷增多，玉米細(xì)菌性莖腐病的發(fā)生也呈現(xiàn)逐年加重趨勢(shì)，20世紀(jì)80年代后期至90年代初期曾在我國(guó)嚴(yán)重發(fā)生.近年來，一些地區(qū)生產(chǎn)中反映該病害又有加重的趨勢(shì)[11，13].為了更好地指導(dǎo)玉米生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)室從海南省南繁基地爆發(fā)玉米莖腐病的地塊中采集了玉米病變組織，進(jìn)行了病原菌的分離，得到了兩株細(xì)菌菌株，命名為JF02和JF04.16S rRNA的DNA序列進(jìn)行測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)二者序列完全相同，并且與玉米狄克氏菌同源性高達(dá)99%[14-15]，進(jìn)一步確定該病原菌為玉米狄克氏菌.

文獻(xiàn)報(bào)道，玉米莖腐病病原多是真菌，又稱為青枯病，該病主要在我國(guó)北方發(fā)生.海南由于其特殊的地理位置，處于高溫高濕的環(huán)境，植物病害的病原菌與中國(guó)內(nèi)地地區(qū)可能存在較大差異，當(dāng)前在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道海南地區(qū)玉米莖腐病的病原菌.通過本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)玉米狄克氏菌是海南南繁基地玉米莖腐病的主要病原菌，這為進(jìn)一步防治該病的發(fā)生，和未來的抗病育種以及分離抗玉米莖腐病基因提供了一定的理論指標(biāo).

[1] 吳海燕， 孫淑榮， 范作偉， 等. 玉米莖腐病研究現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J].玉米科學(xué)， 2007， 15 (4):129-132.

[2] 郭 成， 魏宏玉， 郭滿庫(kù). 玉米穗腐病樣品中黃色鐮孢的分離鑒定及rDNA-ITS序列分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào)， 2013， 22 (2):171-177．

[3] 何 瑞， 王建明. 玉米苗枯病病原菌的分離與鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40(3):260-26．

[4] 陳 楠, 潘曉靜, 姚 遠(yuǎn), 等. 東北地區(qū)玉米莖腐病鐮孢菌EF-1α基因序列分析鑒定[J]. 玉米科學(xué), 2015, 23 (4):143-148.

[5] 王艷紅, 劉海南, 王艷秋, 等. 玉米莖腐病拮抗放線菌-1的鑒定及其部分生物學(xué)特性[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 42(7):129-132.

[6] 楊麗萍， 楊根華， 李林枝， 等. 玉米細(xì)菌性莖腐病組織中一株新的銅綠假單孢桿菌的分離鑒定.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)[J]. 2014， 16 (1):65-70．

[7] ZHOU J， CHENG Y， LV M， et al.The complete genome sequence ofDickeyazeaeEC1 reveals substantial divergence from otherDickeyastrains and species[J]. BMC Genomics， 2015， 16 (1):1-15．

[8] MARTINEZCISNEROS B A, JUAREZLOPEZ G, VALENCIATORRES N, et al. First report of bacterial stalk rot of maize caused byDickeyazeaein Mexico[J]. Plant Disease, 2014, 98(9): 1267-1267.

[9] 晉齊鳴， 潘順法， 姜晶春， 等. 吉林省玉米莖腐病病原菌組成、分布和優(yōu)勢(shì)種研究[J].玉米科學(xué)， 1995， 15 (10)：44-46．

[10] 金加同， 王桂躍. 浙江省玉米莖腐病病原菌的分離與鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 1989， 1(1):44-46．

[11] 袁虹霞， 閔營(yíng)輝， 張丹丹， 等. 河南省玉米莖腐病病原菌分離與致病性測(cè)定[J].玉米科學(xué)， 2011， 19(6):122-124．

[12] O’ LEARY N D, O’ MAHONY M M, DOBSON A D. Regulation of phenylacetic acid uptake is σ54 dependent inPseudomonasputidaCA-3[J/OL]. BMC Microbiology, 2011, 11(1)：229. [2011-10-13]. http://www.biomedcentral.com/1471-2180/11/229. doi: 10.1186/1471-2180-11-229.

[13] 宋佐衡， 陳 捷， 劉偉成， 等. 遼寧省玉米莖腐病病原菌組成及優(yōu)勢(shì)種研究[J].玉米科學(xué)， 1995， 1(14):41-42．

[14] CHEN Y, LV M, LIAO L, et al. Genetic Modulation of c-di-GMP Turnover Affects Multiple Virulence Traits and Bacterial Virulence in Rice PathogenDickeyazeae[J/OL]. PLoS One, 2016, 11 (11): e0165979[2016-11-17]. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165979.

[15] ZHOU J N, ZHANG H B, LV M F, et al. SlyA regulates phytotoxin production and virulence inDickeyazeaeEC1[J]. Molecular Plant Pathology, 2016, 17(9):1398-1408.

The isolation and identification of maize stalk rot pathogen in Hainan Southern Fan Base

NIU Yinuo1， LIN Baoying2， LIU Quanfeng3， LIU Yongzhen4，WU Jinshan1， RONG Wei1， MEI Shuangshuang1

(1.College of Tropical Agriculture and Forestry，Hainan University， Danzhou， Hainan 571737；2.Hainan Institute for Food Control， Haikou 571001；3.Cangzhou Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Cangzhou， Hebei 061001；4.Cangzhou Plant Protection and Quarantine Station，Cangzhou， Hebei 061000)

To identify the pathogen of maize bacterial stalk rot disease occurred in Southern Fan Base of Hainan Province，the pathogenic bacteria JF02 and JF04 were isolated from the maize stalk rot tissue. Back inoculation assay confirmed that JF02 and JF04 are the pathogen of maize stalk rot disease. In addition， the bacteria strain JF02 and JF04 display the same 16S rRNA sequence and is very closed toDickeyazeaeEC1 (99%)， which indicated that JF02 and JF04 are the same and belongs toDickeyazeae. Overall， this study provide references for the control of maize bacterial stalk rot disease and future screening of resistant maize inbred line．

Maize； stalk rot disease；Dickeyazeae

2017-02-28.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560296)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(314057，314057)．

1000-1190(2017)03-0345-04

Q94

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: mssrw2002@126.com．