張 倩，練順才，安明哲，謝正敏，葉華夏，魏金萍

（1.五糧液股份有限公司,四川宜賓644000； 2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000）

一種檢測釀酒糧食中總糖碳穩(wěn)定同位素的方法

張 倩1，2，練順才1，安明哲1，2，謝正敏1，2，葉華夏1，2，魏金萍1，2

（1.五糧液股份有限公司,四川宜賓644000； 2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000）

建立一種檢測釀酒糧食中總糖碳穩(wěn)定同位素的方法。利用高溫淀粉酶液化釀酒糧食淀粉，提取出總糖，提高了取樣均勻度；利用白炭黑的吸附作用，實(shí)現(xiàn)了對釀酒糧食液化液的熱風(fēng)干燥，相較于冷凍干燥縮短了時(shí)間、降低了成本、減少了能耗；采用元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測釀酒糧食中的總糖碳穩(wěn)定同位素，穩(wěn)定性好、精密度高。

釀酒糧食； 穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜； 總糖碳穩(wěn)定同位素； 白炭黑

在國際上，穩(wěn)定同位素技術(shù)由于揭示了產(chǎn)品特征化合物原子水平的信息，而該信息與原料、工藝息息相關(guān)，因此被廣泛應(yīng)用于蜂蜜、食用油、葡萄酒、果汁飲料等食品的鑒別[1-13]，借鑒于此，穩(wěn)定同位素技術(shù)在白酒鑒別上的運(yùn)用應(yīng)運(yùn)而生[14-16]。白酒的主要有效成分為乙醇，而白酒中乙醇的主要來源是釀酒原材料中的總糖，因此白酒的乙醇δ13C必與釀酒原材料的總糖δ13C同源。前人對這種同源性關(guān)系已有研究[17]，但其檢測過程采用冷凍干燥釀酒糧食糖化液[17]，耗時(shí)長、耗能高，適用于檢測時(shí)間充裕的樣品；本文利用白炭黑的吸附作用，實(shí)現(xiàn)了對釀酒糧食液化液的熱風(fēng)干燥，縮短了時(shí)間、降低了成本，適用于需要快速檢測的樣品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：本地玉米、高粱、大米、糯米、小麥。

材料、試劑：耐高溫淀粉酶（105單位）、白炭黑（五糧液自產(chǎn)，使用前以500℃焙燒2 h）、分析純氧化鈣、0.1 mol/L硫酸溶液、IAEA-CH-6（蔗糖，國際原子能機(jī)構(gòu)IAEA，基于V-PDB計(jì)算δ13C=-10.449%）、USGS24（石墨，美國地質(zhì)勘探局USGS，基于VPDB計(jì)算δ13C=-16.049%）、錫盒（Thermo Fisher公司PN 24006400）。

主要儀器：FOSS CT410旋風(fēng)磨、LG10-2.4A離心機(jī)、Thermo Fisher Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀、Flash 2000-HT元素分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

（1）用旋風(fēng)磨將糧食完全粉碎（全能過120目篩網(wǎng)）后，取糧食粉末25 g加入到含150 mL蒸餾水的燒杯中，持續(xù)攪拌，將混合物煮成糊狀后，加入0.4 mL耐高溫淀粉酶，將燒杯置于95℃恒溫水浴中，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)對糧食進(jìn)行液化，直至液化液不再使碘液變藍(lán)為止。

（2）4000 r/min離心10 min分離出液化液，取10 mL液化液并加入0.2 g CaO粉末，混合均勻后放入90℃水浴5 min，以4000 r/min熱離心5 min，用0.1 mol/L的硫酸溶液將上清液pH值調(diào)節(jié)至5.0～6.0后，按照上清液∶白炭黑=2∶1（mL/g）的比例以每秒1滴的速度緩慢滴入白炭黑中（確保吸附上清液后的白炭黑仍呈疏松不黏膩狀態(tài)），最后放入烘箱中60℃干燥45 min后再升溫至100℃干燥45 min，即制成樣品。

1.2.2 樣品分析

用錫盒包裹樣品，以IAEA-CH-6為標(biāo)準(zhǔn)品、USGS24為質(zhì)控樣，采用元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（EA-IRMS）檢測樣品；所述元素分析條件為：進(jìn)樣器He吹掃流量（Reference）為200 mL/min，氧化爐溫度為960℃，柱溫（Oven）為60℃，載氣He（Carrier）流量為110 mL/min；穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜條件如下：離子源真空為1.3× 10-6mBar，電壓為3.06 kV。

在自然界中，13C/12C變化微小，難以測得其真實(shí)值，故采用相對測量法表示樣品中13C/12C，結(jié)果以δ（千分差%）表示：

δ13C=（R樣品/RV-PDB-1）×1000。

式中：R樣品——樣品中13C/12C比值；

RV-PDB——國際基準(zhǔn)物質(zhì)V-PDB的13C/12C比值，13C /12C=（11237.2±90）×10-6。

本發(fā)明方法中所有數(shù)據(jù)均基于V-PDB標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器穩(wěn)定性

用1.2.1步驟分別處理1份玉米、高粱、大米、糯米、小麥，再取每一種樣品的待測樣品各6個(gè)，按1.2.2步驟檢測，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，將不同釀酒糧食的同一待測樣品重復(fù)檢測6次，結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（STD）均小于穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.15%，說明用EAIRMS測定釀酒糧食中總糖δ13C的穩(wěn)定性很好。

2.2 方法穩(wěn)定性

分別取玉米、高粱、大米、糯米、小麥的同一原樣各6份，按照1.2的方法對每一種釀酒糧食的6份原樣進(jìn)行前處理和分析，結(jié)果見表2。

表1 儀器穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，不同釀酒糧食的6個(gè)原樣經(jīng)過平行實(shí)驗(yàn)后，檢測結(jié)果的STD值均小于穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.15%，說明本方法的精密度高、穩(wěn)定性好。

2.3 干燥方法的影響

分別取玉米、高粱、大米、糯米、小麥的同一原樣各2份，1份按照1.2的方法進(jìn)行前處理和分析；1份在離心分離后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值的糧食液化液后，直接采用冷凍干燥法處理樣品，其他步驟與1.2的方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 干燥方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

從表3可以看出，經(jīng)不同干燥方法處理后，檢測結(jié)果的STD值均小于穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.2%，數(shù)據(jù)基本無區(qū)別，說明本方法的檢測準(zhǔn)確度與現(xiàn)有方法相當(dāng)，熱風(fēng)干燥法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響；另外，本實(shí)驗(yàn)中熱風(fēng)干燥耗時(shí)遠(yuǎn)少于冷凍干燥，既降低了成本、又減少了能耗。

2.4 耐高溫淀粉酶的影響

分別取玉米、高粱、大米、糯米、小麥的同一原樣各3份，前處理和檢測方法中，除加入耐高溫淀粉的量分別為0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL外，其他步驟與1.2的方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4。

表4 耐高溫淀粉酶對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

從表4可以看出，隨著耐高溫淀粉酶的增加，各樣品中總糖δ13C測試值并無明顯變化，其STD也均小于穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.15%，說明耐高溫淀粉酶的加入不會影響樣品總糖δ13C的測試。

3 結(jié)論

現(xiàn)有的總糖δ13C的檢測過程采用冷凍干燥方法處理釀酒糧食糖化液，耗時(shí)長、耗能高，適用于檢測時(shí)間充裕的樣品；本文利用白炭黑的吸附作用，實(shí)現(xiàn)了對釀酒糧食液化液的熱風(fēng)干燥，將干燥時(shí)間從至少16 h縮短至2 h以內(nèi)，既降低了成本，又減少了能耗，適用于需要快速檢測的樣品。本方法穩(wěn)定性好、精密度高，為釀酒糧食總糖碳穩(wěn)定同位素的檢測提供了新的選擇。

[1] KELLY S D,RHODES C.Emerging techniques in vegetable oil analysis using stable isotope ratio mass spectrometry[J].Grasas y aceites,2002,53(1)：34-44.

[2] FEDERICA C,ANITA P,LUANA B,et al.The use of IRMS,1H NMR and chemical analysis to characterise Italian and imported Tunisian olive oils[J].Food chemistry,2016,196：98-105.

[3] TANJA P,NIVES O,DORIS P,et al.Fatty acid composition and δ13C isotopic ratio characterisation of pumpkin seed oil[J].Journal of food composition and analysis,2016,53：85-90.

[4] CROFT L R.Stable isotope mass spectrometry in honey analysis[J].trac trends in analytical chemistry,1987,6(8)：206-209.

[5] 胡柳花,李沈軼,李玉偉,等.利用穩(wěn)定碳同位素的EAIRMS分析法研究植物糖漿對蜂蜜的影響[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2)：239-242.

[6] MURAT T.Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with13C/12C isotope ratio analysis method[J].Food chemistry,2013,138(2/3)：1629-1632.

[7] CRITTENDEN R G,ANDREW A S,LE FOURNOUR M,et al.Determining the geographic origin of milk in Australasia using multi-element stable isotope ratio analysis[J].International dairy journal,2006,17(5)：421-428.

[8] MARIJAN N,DORIS P,NIVES O.Discrimination between Slovenian cow,goat and sheep milk and cheeseaccording to geographical origin using a combination of elemental content and stable isotope data[J].Journal of food composition and analysis,2016,52：16-23.

[9] WAYNE A S,GORDHAN P,MARK H,et al. Stable carbon isotope ratio analysis of Australian orange juices[J].Food chemistry,2000,70(3)：385-390.

[10] KARMEN B B,KLEMEN E,DARJA M,et al.Isotopic and elemental characterisation of Slovenian apple juice according to geographical origin:preliminary results[J]. Food chemistry,2016,203：86-94.

[11] ERIC J,JAVIER G,GéRALD R,et al.Improved detection of sugar addition to apple juices and concentrates using internal standard13C IRMS[J]. Analytica chimica acta,1997,347(3)：359-368.

[12] CATERINA D,LUCIA B,LUANA B,et al.From soil to grape and wine:variation of light and heavy elements isotope ratios[J].Food chemistry,2016,210：648-659.

[13] FEDERICA C,NIKOLA D,RON W,et al.Climatic and geographical dependence of the H,C and O stable isotope ratios of Italian wine[J].Analytica chimica acta, 2015,853：384-390.

[14] 鐘其頂,王道兵,熊正河.固態(tài)法白酒與固液法白酒的同位素鑒別技術(shù)[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2014,35(1)：66-71.

[15] 源坤鑒酒技術(shù)團(tuán)隊(duì)(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院).穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)在酒行業(yè)的應(yīng)用(上)[N].華夏酒報(bào),2015-06-02.

[16] 源坤鑒酒技術(shù)團(tuán)隊(duì)(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院).穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)在酒行業(yè)的應(yīng)用(下)[N].華夏酒報(bào),2015-06-09.

[17] 王道兵,鐘其頂,李國輝,等.發(fā)酵乙醇中13C/12C分布的影響因素研究[J].釀酒科技,2014(11)：6-9.

Detection of δ13C of Total Sugar in Liquor-Making Grains

ZHANG Qian1,2,LIAN Shuncai1,AN Mingzhe1,2,XIE Zhengmin1,2,YE Huaxia1,2and WEI Jinping1,2
(1.Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;2 Key Lab of Solid-state Fermentation of Nongxiang Baijiu,Yibin,Sichuan 644000,China)

A method for detecting stable carbon isotope ratio(δ13C)of total sugar in liquor-making grains had been developed.The total sugar was extracted by using high-temperature amylase to improve the sampling uniformity.Then white carbon black was used to achieve heat-drying of liquefied liquid.Compared with freeze-drying,heat-drying could shorten the drying time,reduce production costs and decrease energy consumption.Element analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry(EA-IRMS)for the detection of δ13C of total sugar in liquor-making grains had the advantages of good stability,high precision,etc.

liquor-making grains;IRMS;δ13C of total sugar;white carbon black

TS262.3；TS261.2；TS261.7

A

1001-9286（2017）06-0071-03

10.13746/j.njkj.2016335

2016-11-10

張倩（1987-），女，碩士研究生，主要從事白酒及其原料的穩(wěn)定同位素研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-03-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170327.1451.003.html。