郭 睿，楊小強(qiáng)，江小斌，王洪城，陳秀霞，方冬蘭，龔 暉*

(1.福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350026；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

抗原鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)對(duì)金魚(Carassiusauratus)體液免疫的影響研究

郭 睿1，楊小強(qiáng)1，江小斌1，王洪城1，陳秀霞2，方冬蘭2，龔 暉2*

(1.福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350026；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

以鑰孔戚血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)為抗原、Montanide ISA 763 A為佐劑開展金魚免疫試驗(yàn)，檢測(cè)血清抗體水平，評(píng)估金魚體液免疫應(yīng)答情況，以期為其免疫策略的制定提供依據(jù)。試驗(yàn)在水溫15～18℃時(shí)進(jìn)行，采用(20±3)g體重的健康魚150 尾，隨機(jī)均分為三組，第一組使用(KLH+Montanide ISA 763 A)免疫，第二組僅使用KLH免疫，第三組注射等量的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered solution，PBS)為對(duì)照，歷經(jīng)三次免疫并對(duì)4次采樣的血清樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，第一組和第二組均檢測(cè)到較高的抗KLH抗體水平，在第二次、第三次免疫后，添加ISA佐劑的第一組抗體仍維持較高水平，而在僅用KLH免疫的第二組抗體水平下降，并降低到對(duì)照組水平，表明使用(KLH+Montanide ISA 763 A)免疫金魚可以獲得更加持久和穩(wěn)定的免疫效果，而僅注射KLH的免疫效果較為短暫。研究還說(shuō)明金魚在低溫情況下，可以產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答。

鑰孔戚血藍(lán)蛋白；金魚；體液免疫；Montanide ISA 763 A

金魚(Carassiusauratus)隸屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鯽屬，是我國(guó)傳統(tǒng)的、人們樂(lè)于飼養(yǎng)的名貴觀賞魚類，由于金魚種質(zhì)退化嚴(yán)重和遺傳多樣性較低，使其抵抗病害的能力下降，在環(huán)境稍有改變或養(yǎng)殖管理不當(dāng)時(shí)便會(huì)遭受病害侵襲，造成大量經(jīng)濟(jì)損失。為減輕損失和減少在金魚病害防治中的藥物濫用，而且采用免疫增強(qiáng)的方式提高魚體自身的免疫機(jī)能和增強(qiáng)其對(duì)病害的抵抗力是可行的[1]，因此有必要選擇合適的免疫增強(qiáng)物質(zhì)提高金魚免疫力和開展金魚免疫學(xué)研究。

血藍(lán)蛋白是一種廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的攜氧糖蛋白，因其具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和自組裝特性而被歸為模式蛋白[2]，其中從腹足綱軟體動(dòng)物大鎖孔帽貝(Megathuracrenulata)中提取的鑰孔戚血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)是一種已經(jīng)確定的免疫增強(qiáng)物質(zhì)和半抗原載體[3-4]，并常用于大鼠等哺乳動(dòng)物的免疫研究，比如Roman等[5]使用市場(chǎng)上常見的三種口服影響免疫的藥物制劑對(duì)經(jīng)KLH免疫的大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，以比較這些藥物制劑影響機(jī)體免疫功能的差異；Funes等[6]在建立的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，發(fā)現(xiàn)格-巴二氏綜合征的誘發(fā)與免疫試驗(yàn)兔時(shí)使用的KLH有關(guān)，而且KLH對(duì)試驗(yàn)中抗體的產(chǎn)生是必須的。但在低等脊椎動(dòng)物魚類中，使用KLH開展免疫試驗(yàn)僅有數(shù)篇報(bào)道：Dos Santos等[7]采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)的方法分別以鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaespp.piscicida)和二硝基苯酚偶聯(lián)KLH為抗原免疫狼鱸(Dicentrarchuslabrax)以測(cè)定特異抗體分泌細(xì)胞的數(shù)目；Drennan等[8]使用白鱘虹彩病毒和異硫氰酸熒光素偶聯(lián)KLH并使用弗氏完全佐劑免疫美洲白鱘(Acipensertransmontanus)以研究其血清和皮膚黏膜抗體反應(yīng)；Swan等[9]使用異硫氰酸熒光素偶聯(lián)KLH免疫虹鱒(Oncorhynchusmykiss)以研究其局部黏膜免疫反應(yīng)；Heather等[10]通過(guò)腹腔注射或浸泡二硝基苯酚偶聯(lián)KLH的方法免疫斑馬魚(Daniorerio)以研究魚體獲得性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。除了上述Heather等[10]在斑馬魚中應(yīng)用KLH的研究外，尚沒(méi)有將KLH作為抗原應(yīng)用于其他鯉科魚類的報(bào)道。金魚在養(yǎng)殖過(guò)程中易受到各種病原的侵染，體內(nèi)存在多種細(xì)菌和寄生蟲抗原的抗體，為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采用KLH作為標(biāo)準(zhǔn)抗原免疫金魚，以驗(yàn)證其在金魚免疫研究中的可行性。

Montanide ISA為法國(guó)SEPPIC公司生產(chǎn)的油乳佐劑，其與抗原乳化后能產(chǎn)生較高的抗體滴度和免疫保護(hù)率，同時(shí)毒副作用遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)弗氏佐劑，不會(huì)產(chǎn)生肉芽腫或組織粘連[11]。近年來(lái)ISA佐劑使用較多，在水產(chǎn)魚類上已用于香魚(Plecoglossusaltivelis)[12]、大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)[13]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[14]、瘤棘鲆(Psettamaxima)[15-16]、鯉(Cyprinuscarpio)[17]、大西洋鮭(Salmosalar)[18]、虹鱒[19-21]。其中，Montanide ISA 763 A是一種可生物降解的油包水型(W/O)非礦物油佐劑，有多篇用于魚類的研究報(bào)道[12，14-16，18-21]，但尚沒(méi)有與KLH乳化后免疫金魚的報(bào)道。

本研究采用腹腔注射的方式使用KLH免疫金魚，選用Montanide ISA 763 A作為佐劑或不添加佐劑，比較了(KLH+Montanide ISA 763 A)和僅使用KLH的免疫效果差異，評(píng)估了金魚在低溫情況下的體液免疫應(yīng)答情況，同時(shí)驗(yàn)證KLH作為抗原在鯉科魚類金魚免疫研究中的可行性，以期選擇合適的免疫增強(qiáng)物質(zhì)，為金魚免疫策略的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用金魚150尾，體重(20±3)g、體長(zhǎng)(6.0±0.5)cm，由福州某金魚養(yǎng)殖場(chǎng)提供，后續(xù)免疫試驗(yàn)也在該場(chǎng)進(jìn)行。KLH購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó))，按說(shuō)明配制成0.1 μg/μL的儲(chǔ)存液。佐劑Montanide ISA 763 A購(gòu)自Seppic(法國(guó))，3∶7乳化后使用，乳化后KLH工作液濃度為0.03 μg/μL。BALB/c小鼠2只，購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó))，羊抗鼠-HRP酶標(biāo)抗體購(gòu)自Abclonal(美國(guó))，其他所用試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)藥品配制。

1.2 免疫

為便于管理和飼養(yǎng)，將試驗(yàn)魚分為三組，每組50尾，在水溫15～18℃時(shí)，采用腹腔注射的方式累計(jì)免疫金魚三次，每次每尾200 μL。第一組(KLH+ISA)注射KLH∶ISA=3∶7的乳化液；第二組(KLH)注射使用0.01 mol/L PBS按體積比KLH∶PBS=3∶7稀釋的KLH；第三組(PBS)注射0.01 mol/L PBS。免疫過(guò)程如圖1所示。

1.3 樣本采集

如圖1所示，參照田丁等[22]和陳秀霞等[23]的方法，每次采樣3～5尾即可用于抗體檢測(cè)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本實(shí)驗(yàn)每次采樣5尾，并在免疫前后使用1 mL無(wú)菌注射器尾靜脈采集金魚血液樣本4次，將所采集的樣本4℃靜置過(guò)夜，次日7 500 rpm離心10 min取上層血清，置于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鼠抗金魚血清多克隆抗體的制備

參考陳垚等[24]采用鹽析法分離純化鯽魚血清免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的方法，具體步驟如下：取適量免疫前的金魚血清相互混合，加入等量飽和硫酸銨溶液(SAS)4℃過(guò)夜沉淀，次日10 000 rpm離心10 min，棄上清液后加入10倍體積的0.01 mol/L PBS重懸沉淀。將重懸液加入經(jīng)碳酸氫鈉和EDTA煮沸處理的截留分子量14 000 Da的透析袋中，置于0.01 mol/L PBS中4℃透析48 h，期間更換透析液PBS三次。將透析袋取出，使用蔗糖濃縮血清IgM，取樣并使用BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo，美國(guó))測(cè)定蛋白濃度，采用軟件Quantity One v462分析免疫球蛋白含量，并將透析后的純化血清IgM置于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

取上述純化的血清IgM 100 μL，經(jīng)測(cè)定濃度為0.700 mg/mL，與FCA按體積比1∶1混勻，取混合液腹腔注射2 只BALB/c小鼠，每只200 μL，第一次免疫后15 d再次與FIA 1∶1混勻，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行第二次免疫，之后20 d采用摘眼球取血法收集小鼠血液，4℃靜置過(guò)夜后，8 500 rpm離心10 min后取上清液，置于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 鼠抗金魚血清抗體效價(jià)的測(cè)定

取免疫前血清樣本1 000倍稀釋，每孔50 μL包被96孔板，4℃過(guò)夜。次日每孔使用100 μL 2% BSA PBST 37℃封閉2 h，經(jīng)甩干后每孔加入50 μL 1% BSA PBST稀釋的鼠抗金魚血清每行1∶50起倍比稀釋11孔，并作一列平行，同時(shí)設(shè)置PBS空白對(duì)照，37℃反應(yīng)2 h，之后使用PBST洗板3次，再每孔加入50 μL 1% BSA PBST稀釋的羊抗鼠-HRP酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)90 min，接著使用PBST洗板3 次后，每孔加入50 μL顯色底物OPD，37℃顯色30 min，最后加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，并使用Bio-Rad xMark酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，記錄鼠抗金魚血清抗體的最佳稀釋度。

1.6 金魚血清抗KLH抗體的效價(jià)測(cè)定

配制KLH溶液，使KLH終濃度為10 μg/mL，每孔50 μL包被96孔板，4℃過(guò)夜。次日每孔使用100 μL 2% BSA PBST 37℃封閉2 h，經(jīng)甩干后每孔加入50 μL 1% BSA PBST 50倍稀釋的4批次采樣的金魚血清，37℃反應(yīng)2 h，之后使用PBST洗板3次，再每孔加入50 μL 1% BSA PBST稀釋的最佳稀釋度的鼠抗金魚血清，37℃反應(yīng)90 min，接著使用PBST洗板3 次后，每孔加入50 μL 1% BSA PBST稀釋的羊抗鼠-HRP酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)90 min，隨后使用PBST洗板3次，每孔加入50 μL顯色底物OPD，37℃顯色20 min后加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，并使用Tecan Infinite M200酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

應(yīng)用SPSS Statistics version 22對(duì)酶標(biāo)儀測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Ducan多重比較，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。使用GraphPad Prism version 5.01對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 鼠抗金魚血清抗體效價(jià)

免疫前，金魚血清經(jīng)50% SAS沉淀并透析后，其蛋白濃度為0.700 mg/mL，其中血清免疫球蛋白占47.69%，使用該血清免疫2只小鼠，經(jīng)過(guò)二次免疫后測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果見表1，由于制備的小鼠抗血清較少，故選擇鼠抗金魚血清抗體的工作濃度為1∶400。

表1 鼠抗金魚血清抗體效價(jià)Tab.1 Antibody titer of mouse anti-goldfish whole serum

2.2 金魚血清樣本中抗KLH的抗體效價(jià)

測(cè)定金魚4次采樣后血清中抗KLH的抗體效價(jià)，并對(duì)其進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示(表2)，并依據(jù)各組數(shù)據(jù)制作柱狀圖(圖2)。由結(jié)果可知，使用KLH腹腔注射金魚后，實(shí)驗(yàn)組均產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，第一次免疫后20 d KLH組和PBS組差異極顯著(P<0.01)，KLH組與其他兩組差異顯著(P<0.05)，表明無(wú)佐劑組比佐劑組產(chǎn)生較高抗體效價(jià)；第二次免疫后33 d，(KLH+ISA)組與PBS組差異顯著(P<0.05)；第三次免疫后23 d，( KLH+ISA)組與其他兩組差異極顯著(P<0.01)，表明在第二次、第三次免疫后，佐劑組檢測(cè)出比無(wú)佐劑組更高的效價(jià)。

表2 免疫后各組抗體效價(jià)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Tab.2 Antibody titer of the three groups after immunization(mean±standard deviation)

注：同列肩標(biāo)大寫字母不同者差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)小寫字母不同者差異顯著(P<0.05)。
Notes：In the same column，values with different capitals meaned very significant difference(P<0.01)，and values with different minuscules meaned significant difference(P<0.05).

注：同一組柱圖上標(biāo)大寫字母不同者差異極顯著(P<0.01)，上標(biāo)小寫字母不同者差異顯著(P<0.05)。
Notes：In the same group，values with different capitals meaned very significant difference(P<0.01)，and values with different minuscules meaned significant difference(P<0.05).

3 討論

魚類在受到病原感染或人工免疫后，均能產(chǎn)生由免疫球蛋白介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，這些免疫球蛋白在魚體的免疫防御中起著十分重要的作用，在多種免疫球蛋白中IgM的含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不僅是適應(yīng)性體液免疫反應(yīng)中出現(xiàn)的第一種免疫球蛋白，而且非特異性的IgM還是天然免疫系統(tǒng)中的一道有效屏障[25]。本研究從金魚血清中純化IgM，用其免疫小鼠以制備鼠抗金魚血清多克隆抗體并選擇工作濃度為1∶400，這一較高稀釋度可能與免疫小鼠用金魚血清蛋白濃度較低有關(guān)，但也適用后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，該多克隆抗體可以將金魚血清與商品化的羊抗小鼠-HRP酶標(biāo)抗體相偶聯(lián)，以完成后續(xù)抗體水平的免疫應(yīng)答檢測(cè)。

KLH是一種具有高免疫原性和穩(wěn)定性的T細(xì)胞依賴性抗原，在體液免疫應(yīng)答中需要在T細(xì)胞輔助下激活B細(xì)胞以產(chǎn)生抗體[5]。KLH在之前魚類相關(guān)報(bào)道中都是作為半抗原，并結(jié)合異硫氰酸熒光素或二硝基苯酚以開展免疫實(shí)驗(yàn)[7-10]。近年來(lái)，佐劑(Adjuvants)被重新定義為一系列在結(jié)構(gòu)上由不同物質(zhì)構(gòu)成，具有調(diào)節(jié)抗原固有免疫原性能力的物質(zhì)，當(dāng)前依據(jù)其引發(fā)的免疫學(xué)反應(yīng)分為兩類，一類(signal 1)為影響疫苗抗原在時(shí)間、空間和濃度上的作用，并最終提高其免疫效率；另一類(signal 2)為在抗原識(shí)別期間提供共刺激信號(hào)，并產(chǎn)生適合大部分適應(yīng)性抗原特異性免疫反應(yīng)的環(huán)境[11，26]。Montanide ISA 763 A佐劑和常規(guī)的弗氏佐劑都屬于signal 1中的油乳狀劑，但后者在魚類免疫研究中使用并不總是能提高抗原的免疫原性或保護(hù)率，而且使用后具有較大的毒副作用[11]，不宜用于生產(chǎn)[27]，而前者ISA佐劑已經(jīng)商品化并有專門適用魚類的佐劑763 A，而且已有多篇報(bào)道表明其可使魚類產(chǎn)生更高的免疫保護(hù)率(Relative percent survival，RPS)[12，14-16，18-21]。

本文使用KLH免疫金魚，并比較了添加和不添加ISA763 A佐劑對(duì)其免疫反應(yīng)的影響。對(duì)于(KLH+ISA)組，間隔20～30 d三次免疫后在金魚血清中均檢測(cè)到抗KLH的抗體，并且存在持續(xù)升高的趨勢(shì)和較長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，與Ravelo等[19]使用ISA 763 A作為佐劑免疫虹鱒4周后攻毒RPS為82.6%和6個(gè)月后攻毒RPS依然高達(dá)90%的報(bào)道相近。對(duì)于KLH組，在第一次免疫后20 d檢測(cè)到較(KLH+ISA)組更高的抗體效價(jià)，可用油乳狀佐劑中存在的“倉(cāng)庫(kù)效應(yīng)(Depot effect)”解釋，即無(wú)佐劑組直接大量免疫會(huì)短時(shí)間內(nèi)加強(qiáng)體液免疫，而采用佐劑組緩慢地釋放抗原到組織或血液持續(xù)地刺激機(jī)體，可以加強(qiáng)免疫反應(yīng)和延長(zhǎng)機(jī)體的體液免疫時(shí)間[28]，相似地，在Thim等[18]使用ISA 763 A免疫大西洋鮭的研究中認(rèn)為油乳佐劑創(chuàng)造了“抗原倉(cāng)庫(kù)”，這一倉(cāng)庫(kù)可促進(jìn)抗原傳遞到抗原呈遞細(xì)胞或形成目標(biāo)吸引效應(yīng)細(xì)胞的到來(lái)。在第二次、第三次免疫后，佐劑組抗體效價(jià)高于無(wú)佐劑組，除了與抗原緩慢釋放和持續(xù)刺激有關(guān)外，還與佐劑能更好地促進(jìn)免疫魚產(chǎn)生二次免疫應(yīng)答有關(guān)，比如在抗原呈遞過(guò)程中增加中和抗體反應(yīng)，延長(zhǎng)免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間；促進(jìn)抗原蛋白在胞質(zhì)加工成適合主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ型分子(MHC-Ⅰ)結(jié)合的肽段等[29]。Trump等[30]在水溫20℃時(shí)使用BSA免疫金魚發(fā)現(xiàn)，初次免疫后17 d檢出抗體，50 d達(dá)到峰值，再次免疫后7 d檢出抗體，30 d達(dá)到峰值。由于本實(shí)驗(yàn)在較低水溫15～18℃進(jìn)行，故第二次、第三次免疫后的采樣檢測(cè)時(shí)間相對(duì)滯后以期檢測(cè)到峰值，不過(guò)與無(wú)佐劑組相比，佐劑組在第二次、第三次免疫后均可檢出較高的抗體效價(jià)。

4 結(jié)論

本研究使用KLH免疫金魚并在其血清中檢出了抗KLH的抗體，驗(yàn)證了KLH在鯉科魚類金魚免疫研究中應(yīng)用的可行性，比較了添加或不添加Montanide ISA 763 A佐劑對(duì)金魚體液免疫效果的差異，并對(duì)其免疫后血清抗體的變化情況作了初步探討。KLH作為抗原，具有較高的免疫原性，可以誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生較多特異性抗體，被認(rèn)為是具有免疫增強(qiáng)作用的物質(zhì)[4]，而ISA 763 A可以提高其免疫效力和持續(xù)時(shí)間，同時(shí)Jaafar等[21]認(rèn)為僅用ISA 763 A免疫即可激活先天性免疫并強(qiáng)烈刺激B細(xì)胞產(chǎn)生大量抗體(IgM)，故希望(KLH+ISA)的有機(jī)結(jié)合可以提高金魚免疫力，后續(xù)還將開展實(shí)驗(yàn)室可控的以金魚常見病原進(jìn)行攻毒的研究，以驗(yàn)證其免疫保護(hù)效果，為進(jìn)一步制定金魚免疫策略提供參考依據(jù)。

[1]姜因萍，吳后波，何毛賢.魚類免疫促進(jìn)劑研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2006，30(7)：86-90.

[2]Van-Holde K，Miller K H.Hemocyanins and invertebrate evolution[J].Journal of Biological Chemistry，2001，276(19)：15563-15566.

[3]Harris J R，Markl J.Keyhole limpet hemocyanin(KLH)：a biomedical review[J].Micron，1999，30(30)：597-623.

[4]Markl J，Lieb B，Gebauer W，et al.Marine tumor vaccine carriers：structure of the molluscan hemocyanins KLH and HtH[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，2001，127(2)：R3-R9.

[5]Roman D，Ulrich P，Paul G，et al.Determination of the effect of calcineurin inhibitors on the rat’s immune system after KLH immunization[J].Toxicology Letters，2004，149(1-3)：133-140.

[6]Funes S C，Chiari M E，Comín R，et al.Experimental Guillain-Barre syndrome induced by immunization with gangliosides：keyhole limpet hemocyanin is required for disease triggering[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease，2017，1863(6)：1473-1478.

[7]Dos Santos N M，Taverne-Thiele J J，Barnes A C，et al.Kinetics of juvenile sea bass(Dicentrarchuslabrax，L.)systemic and mucosal antibody secreting cell response to different antigens(Photobacteriumdamselaespp.piscicida，Vibrioanguillarumand DNP)[J].Fish & Shellfish Immunology，2001，11(4)：317-331.

[8]Drennan J D，Lapatra S E，Swan C M，et al.Characterization of serum and mucosal antibody responses in white sturgeon(AcipensertransmontanusRichardson)following immunization with WSIV and a protein hapten antigen[J].Fish & Shellfish Immunology，2007，23(3)：657-669.

[9]Swan C M，Lindstrom N M，Cain K D.Identification of a localized mucosal immune response in rainbow trout，Oncorhynchusmykiss(Walbaum)，following immunization with a protein-hapten antigen[J].Journal of Fish Diseases，2008，31(5)：383-393.

[10]Heather W，Chen P L，Deiss T C，et al.DNP-KLH yields changes in leukocyte populations and immunoglobulin isotype use with different immunization routes in zebrafish[J].Frontiers in Immunology，2015，6(12)：1-8.

[11]Tafalla C，B?gwald J，Dalmo R A.Adjuvants and immunostimulants in fish vaccines：current knowledge and future perspectives[J].Fish & Shellfish Immunology，2013，35(6)：1740-1750.

[12]Ninomiya K，Yamamoto M.Efficacy of oil-adjuvanted vaccines for bacterial hemorrhagic ascites in ayuPlecoglossusaltivelis[J].Fish Pathology，2001，36(3)：183-185.

[13]Bowden T J，Adamson K，Maclachlan P，et al.Long-term study of antibody response and injection-site effects of oil adjuvants in Atlantic halibut(HippoglossushippoglossusL.)[J].Fish Shellfish Immunol，2003，14(4)：363-369.

[14]李華，錢永華，石存斌，等.二種佐劑對(duì)哈氏弧菌OMPC-溶藻弧菌LPS偶聯(lián)疫苗的增效作用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26(9)：489-493.

[15]Lamas J，Sanmartín M L，Paramá A I，et al.Optimization of an inactivated vaccine against a scuticociliate parasite of turbot：Effect of antigen，formalin and adjuvant concentration on antibody response and protection against the pathogen[J].Aquaculture，2008，278(1-4)：22-26.

[16]Sitjà-Bobadilla A，Palenzuela O，Alvarez-Pellitero P.Immune response of turbot，Psettamaxima(L.)(Pisces：Teleostei)，to formalin-killed scuticociliates(Ciliophora)and adjuvanted formulations[J].Fish & Shellfish Immunology，2008，24(1)：1-10.

[17]Poobalane S，Thompson K D，Ardó L，et al.Production and efficacy of anAeromonashydrophilarecombinant S-layer protein vaccine for fish[J].Vaccine，2010，28(20)：3540-3547.

[18]Thim H L，Villoing S，Mcloughlin M，et al.Vaccine adjuvants in fish vaccines make a difference：comparing three adjuvants(Montanide ISA763A Oil，CpG/Poly I：C Combo and VHSV Glycoprotein)alone or in combination formulated with an inactivated whole salmonid alphavirus antigen[J].Vaccines，2014，2(2)：228-251.

[20]Bastardo A，Ravelo C，Castro N，et al.Effectiveness of bivalent vaccines againstAeromonashydrophilaandLactococcusgarvieaeinfections in rainbow troutOncorhynchusmykiss(Walbaum)[J].Fish & Shellfish Immunology，2012，32(5)：756-761.

[21]Jaafar R M，Chettri J K，Dalsgaard I，et al.Effects of adjuvant Montanide(TM)ISA 763 A VG in rainbow trout injection vaccinated againstYersiniaruckeri[J].Fish & Shellfish Immunology，2015，47(2)：797-806.

[22]田丁，許斌福，林能峰，等.創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白免疫刺激復(fù)合物對(duì)歐洲鰻鱺的免疫保護(hù)性分析[J].水生生物學(xué)報(bào)，2010，34(2)：431-435.

[23]陳秀霞，黃殿盛，柯翎，等.BSA-ISCOMs對(duì)大黃魚免疫機(jī)能及抗病力的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，28(3)：201-205.

[24]陳垚，王石泉，韓曉冬，等.鯽魚血清和皮膚粘液IgM的分離純化及部分性質(zhì)的鑒定[J].動(dòng)物學(xué)研究，2003，24(2)：111-115.

[25]葉劍敏，王玉紅，丁明媚，等.硬骨魚IgM結(jié)構(gòu)和功能及其體液免疫應(yīng)答[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，47(5)：1-8.

[26]Guy B.The perfect mix：recent progress in adjuvant research[J].Nature Reviews Microbiology，2007，5(7)：505-517.

[27]R?rstad G，Aasjord P M，Robertsen B.Adjuvant effect of a yeast glucan in vaccination against furunculosis in Atlantic salmon(SalmosalarL.)[J].Fish & Shellfish Immunology，1993，3(3)：179-190.

[28]Anderson D P.Adjuvants and immunostimulants for enhancing vaccine potency in fish[J].Developments in Biological Standardization，1997，90(90)：257-265.

[29]劉振興，張殿昌，龔世園.魚用免疫佐劑的研究概況[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2007，27(2)：3-6.

[30]Trump G N，Hildemann W H.Antibody responses of goldfish to bovine serum albumin.Primary and secondary responses[J].Immunology，1970，19(4)：621-627.

Effect of keyhole limpet hemocyanin(KLH)as antigen on humoral immunity in goldfish(Carassiusauratus)

GUO Rui1，YANG Xiaoqiang1，JIANG Xiaobin1，WANG Hongcheng1，CHEN Xiuxia2，F(xiàn)ANG Donglan2，GONG Hui2*

(1.Fuzhou Ocean and Fisheries Technology Center，F(xiàn)uzhou 350026，China；2.Institute of Biotechnology，F(xiàn)ujian Provincial Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003，China)

In order to provide enough reference material for enacting immune strategy of goldfish(Carassiusauratus)，KLH was used as antigen to immunize it with adjuvant Montanide ISA 763 A，and the serum antibody level was detected to evaluate the humoral immunoresponse.The experiment was carried out under 15～18℃ and 150 healthy fish with body weight of(20±3)g were randomly divided into 3 groups.Group Ⅰ was immunized with(KLH+Montanide ISA 763A)，Group Ⅱ was merely immunized with KLH and Group Ⅲ was intraperitoneal injected with equivalent PBS as control.Antiserum was sampled after using KLH plus ISA adjuvant or not from the immunized fish three times，and the antibody variation was evaluated by ELISA.As a result，the antibody level in Group Ⅰ and Group Ⅱ were high.The antibody level of Group Ⅰ was still high after the first and second booster immunization，while that of Group Ⅱ were decreased and approached to the level of Group Ⅲ.We found the fish immunized with KLH plus ISA could acquire a long and stable immunity，while the fish merely immunized with KLH could get a short and transitory one.This study also showed the goldfish possessed well humoral immunoresponse in hypothermia situation.

keyhole limpet hemocyanin；goldfish；humoral immunity；Montanide ISA 763 A

2017-04-21

2016年福州市漁業(yè)病蟲害研究、檢測(cè)項(xiàng)目(2200209)；2016年福州市水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種引進(jìn)推廣項(xiàng)目(2130106).

郭 睿(1986-)，男，河北石家莊人，工程師/執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，從事水生動(dòng)物遺傳和疫病研究.E-mail：ariesgreen86@hotmail.com

龔 暉(1971-)，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病原學(xué)與免疫學(xué).E-mail：ghxfjm@163.com

郭 睿，楊小強(qiáng)，江小斌，等.抗原鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)對(duì)金魚(Carassiusauratus)體液免疫的影響研究[J].漁業(yè)研究，2017，39(3)：165-171.

S942.1

A

1006-5601(2017)03-0165-07