程小珍 謝宗宙 崔榮花 張曙波 毛山山 王美清

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CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞對晚期肺癌患者免疫抑制作用的研究

程小珍 謝宗宙 崔榮花 張曙波 毛山山 王美清

目的 探討Treg及Th1/Th2類細胞因子在晚期肺癌腫瘤免疫抑制中的作用。方法 選取100例初治晚期肺癌患者及50例健康自愿者。采用流式細胞術檢測其外周血中Treg、Th1類細胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-a)、Th2類細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)水平，同時分析CD4+CD25+Treg與Th1/Th2類細胞因子之間的相關性。結果 ①晚期肺癌患者外周血中Treg為(11.12±5.83)%，高于健康對照組(7.46±3.07)%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)；②化療前肺癌患者外周血中Treg為(11.12±5.83)%，明顯高于化療后(6.45±3.74)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；③晚期肺癌患者與正常對照組Th1/Th2類細胞因子水平分別為：IFN-γ(8.56±3.62 vs 10.79±3.27，P=0.049)、IL-2(8.48±2.87 vs 10.22±4.03，P=0.03)、TNF-a(6.18±2.67vs8.14±2.87，P=0.007)、IFN-γ/IL-4(3.33±1.44 vs 4.09±1.00，P=0.028)、IL-4(3.17±1.19 vs 2.45±0.43，P<0.001)、IL-6(3.88±2.08 vs 2.33±0.88，P<0.001)、IL-10(3.64±1.73 vs 2.54±1.08，P=0.008)，其中Th2類因子水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；④CD4+CD25+Treg與Th1類細胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-2及IL-6無相關性(P均>0.05)；與Th1/Th2(γ=-0.273,P=0.003)呈負相關；與Th2類細胞因子IL-4(γ=0.237,P=0.009)、IL-10(0.626，P<0.001)呈正相關(P均<0.05)。結論 晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg、Th2類細胞因子水平顯著升高，Th1類細胞因子水平下降，它們共同導致腫瘤患者免疫抑制及腫瘤進展，監(jiān)測其水平變化有助于判斷肺癌患者療效、預后，有效調控CD4+CD25+Treg及負性細胞因子水平可能是治療肺癌的一個新策略。

肺癌；CD4+CD25+調節(jié)性T細胞；Th1/Th2類細胞因子；免疫抑制

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:378～381)

體內外研究表明，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，大多數惡性腫瘤患者都伴隨著機體免疫功能失調。腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視與腫瘤細胞本身及宿主免疫系統(tǒng)兩方面有關，如腫瘤細胞缺乏共刺激分子誘導T細胞耐受、腫瘤細胞表達共抑制分子PD-L1[1-2]、腫瘤細胞釋放免疫抑制因子TGF-β及IL-10增加等[3]、腫瘤細胞抗原性差、主要組織相容性復合物表達下調、宿主體內免疫抑制細胞數量及功能增強等。

近年來，越來越多的研究發(fā)現免疫抑制細胞及免疫抑制因子，如CD4+CD25+調節(jié)性T細胞、Th1/Th2類細胞因子在腫瘤免疫抑制中的重要作用。多種惡性腫瘤，如肝癌[4]、急性淋巴細胞白血病[5]、胃癌[6]、腎癌[7]等患者外周血中可檢測到CD4+CD25+調節(jié)性T細胞升高，且CD4+CD25+調節(jié)性T細胞水平與腫瘤患者不良預后[8-10]有關。但CD4+CD25+調節(jié)性T細胞作用機制尚不明確，目前研究表明其與細胞因子關系密切，動物實驗[11]發(fā)現去除Treg后，IL-10、TGF-β水平下降；通過聯合吉西他濱化療及CIK免疫治療后，荷瘤裸鼠體內細胞因子IL-10、TGF-β、及IFN-γ水平下降明顯。

本研究采用流式細胞儀來檢測肺癌及健康對照組外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞以及細胞內細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-a、IL-4、IL-6、IL-10水平變化，并分析CD4+CD25+調節(jié)性T細胞與細胞因子的相關性，探討Treg及細胞因子與晚期肺癌患者免疫抑制的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選?、蟆羝诘某踔畏伟┗颊?00例，所有患者均經細胞學或病理組織學證實為肺癌，既往均無免疫性疾病及使用免疫抑制劑病史。肺癌患者中男性82例，女性18 例，年齡為35～70歲，中位年齡58歲；TNM分期為Ⅲ期47例，Ⅳ期53例，其中鱗癌34例，腺癌36例，小細胞癌25例，其他5例；高分化31例，中分化33例，低分化36例。選取同期的健康體檢者50例為正常對照組，其中男性39例，女性11例，年齡為34～69歲，中位年齡59歲。所有肺癌患者均采用含順鉑兩藥聯合方案化療，化療前及化療結束后1周采集外周靜脈血。

1.2 主要實驗試劑及儀器

單克隆抗體使用美國BD公司生產的FITC標記的鼠抗人CD4、IFN-γ、IL-2抗體，PE標記的鼠抗人抗CD25、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a抗體，及同型對照抗體。采用美國BD公司的FACSCanto流式細胞儀進行細胞檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD4+CD25+Treg檢測 于清晨空腹抽取EDTA抗凝外周血5 ml。吸取100 μl EDTA抗凝的外周血至樣品測定管中，加入10 μl FITC標記的鼠抗人CD4及PE標記的鼠抗人抗CD25單克隆抗體，震蕩混勻后在室溫下孵育20 min，然后加入1 ml紅細胞裂解液，離心、棄上清，PBS洗2次，2 h內用FACS Canto流式細胞儀(美國BD公司)檢測。

1.3.2 細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測 采用密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋為1×106細胞/ml備用。取1 ml淋巴細胞懸液置于24孔培養(yǎng)板，各加入10 μl佛波酯、離子霉素、莫能霉素刺激細胞，用500 μl凍固定液(4 ℃)固定細胞(4 ℃冰箱過夜)。取100 μl細胞懸液，加20 μl抗CD4-FITC進行細胞表面抗原染色。然后以1.5 ml打孔液進行細胞打孔，最后各加入10 μl抗IFN-γ-FITC、抗IL-2-FITC、抗TNF-a-PE、抗IL-4-PE、抗IL-6-PE、抗IL-10-PE，并設一管陰性對照，2 h內上流式細胞儀分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 實驗組和對照組外周血CD4+CD25+Treg比例

100例晚期肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg水平為(11.12±5.83)%，明顯高于50例健康對照組的CD4+CD25+Treg水平[(7.46±3.07)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。

2.2 晚期肺癌患者化療前后外周血CD4+CD25+Treg比例

晚期肺癌患者化療前外周血CD4+CD25+Treg水平為(11.12±5.83)%，明顯高于化療后1周CD4+CD25+Treg水平[(6.45±3.74)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3 晚期肺癌患者與健康對照組Th1/Th2類細胞因子水平比較

晚期肺癌患者Th1類細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-a水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Th2類細胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 晚期肺癌患者與健康對照組Th1/Th2類細胞因子水平比較

2.4 CD4+CD25+Treg水平與外周血Th1/Th2類細胞因子的關系

CD4+CD25+Treg與Th1類細胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-2及IL-6無相關性(P均>0.05)；與Th1/Th2(γ=-0.273,P=0.003)呈負相關；與Th2類細胞因子IL-4(γ=0.237,P=0.009)、IL-10(γ=0.626，P<0.001)呈正相關(P均<0.05)。

3 討論

以往基礎及臨床研究發(fā)現，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫抑制性細胞CD4+CD25+Treg關系密切，在多種惡性腫瘤患者的組織標本和外周血中均可檢測到其水平升高。Yamamoto等[12]報道在胰腺癌患者外周血中Treg比例低于正常對照組，手術可切除的患者Treg水平低于未能手術切除的患者。在非小細胞肺癌[3]、肝癌[4]患者研究中也發(fā)現Treg數量和比例的升高，提示腫瘤細胞可能通過分泌趨化因子促進Treg細胞的增殖與分化，但目前尚未見相關研究報導。本研究同樣發(fā)現晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg的比例顯著高于健康體檢者，表明腫瘤患者CD4+CD25+調節(jié)性T細胞是晚期肺癌患者免疫抑制及腫瘤進展的原因之一。本研究還發(fā)現化療后Treg水平下降，提示可能化療后患者體內腫瘤負荷減少，腫瘤細胞分泌的對Treg趨化作用的因子減少，導致Treg水平下降。以上實驗結果表明CD4+CD25+調節(jié)性T細胞比例可能是一個較好的反映細胞免疫功能狀態(tài)的指標，在肺癌治療的不同階段，監(jiān)測其水平變化有助于判斷肺癌患者的療效和預后。

體外細胞及動物實驗研究發(fā)現，Treg可以抑制CD8+T細胞的增殖和活性，抑制CD4+T細胞的輔助性作用，抑制細胞因子IL-2、IFN-γ的產生，降低免疫細胞對腫瘤細胞的免疫應答。Zhou等[13]在小鼠肝癌模型中發(fā)現，用CCL21聯合抗CD25單抗處理小鼠后，可增強抗腫瘤免疫及延長生存期，不僅能抑制腫瘤血管和細胞增殖，而且可導致腫瘤內CD4+T、CD8+T和CD11c+DC數量增加，同時顯著誘導局部腫瘤位點處的腫瘤特異性CD8+細胞毒性T細胞；腫瘤內免疫應答伴有IL-12和IFN-γ的增加，但免疫抑制介質IL-10和TGF-β1的釋放減少。本研究還發(fā)現，晚期肺癌患者外周血中Th1類細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-a水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Th2類因子IL-4、IL-6、IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且CD4+CD25+調節(jié)性T細胞與IL-4、IL-10呈正相關；與Th1/Th2負相關；與IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-y均無明顯相關性。以上實驗結果表明，CD4+CD25+Treg在體內微環(huán)境中的抑制作用與IL-4、IL-10、Th1/Th2比例有關，而非與某一獨立的因素直線相關，IL-4、IL-10水平越高，Th1/Th2比值越低，其作用越強，免疫抑制細胞及免疫抑制因子相互作用，共同促進腫瘤進展。

總之，通過研究我們發(fā)現晚期肺癌患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞水平升高，隨著腫瘤負荷的減少其水平有下降的趨勢；并且腫瘤患者免疫抑制作用與腫瘤微環(huán)境中的Th1/Th2比例及負性細胞因子IL-4、IL-10有關，它們可能可以協(xié)同促進腫瘤進展，但仍需更多的實驗研究來證實其具體作用的分子機制。在肺癌患者治療的不同階段，定期的監(jiān)測其外周血中Treg及細胞因子水平有助于判斷肺癌患者荷瘤狀態(tài)及療效評估。采用有效措施來調節(jié)腫瘤微環(huán)境中Treg細胞數量及功能以及聯合使用抗體調節(jié)Th1/Th2類細胞因子的水平，可能可以增強肺癌患者的療效，這也是未來腫瘤免疫治療的一個方向。

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(編輯：吳小紅)

Study of the Immunosuppressive Effect of CD4+CD25+Regulatory T Cells on Patients with Advanced Lung Cancer

CHENG Xiaozhen,XIE Zongzhou,CUI Ronghua,et al.

Central South University Xiangya School of Medicine Affiliated Haikou Hospital/Haikou People’s Hospital,Haikou,570208

Objective To explore the role of CD4+CD25+regulatory T cells and Th1 and Th2 cytokines in tumor immunosuppression of advanced lung cancer patients.Methods The blood samples of 100 patients with lung cancer and 50 healthy volunteers were collected,and the levels of CD4+CD25+regulatory T cells and Th1and Th2 cytokines in peripheral blood were determined by flow cytometry.The correlation of CD4+CD25+regulatory T cells and Th1 and Th2 cytokines was analyzed.Results

①The proportion of Treg was significantly higher in advanced lung cancer patients(11.12±5.83)% than in healthy donors (7.46±3.07)% (P=0.003);②The proportion of Treg was lower in advanced lung cancer patients treated with chemotherapy(6.45±3.74)% compared to those patients without chemotherapy(11.12±5.83)% (P<0.001);③ The level of Th1 and Th2 cytokines in advanced lung cancer patients and normal controls were:IFN-γ(8.56±3.62 vs 10.79±3.27，P=0.049)、IL-2(8.48±2.87vs10.22±4.03，P=0.03)、TNF-a(6.18±2.67vs8.14±2.87，P=0.007)、IFN-γ/ IL-4(3.33±1.44vs4.09±1.00，P=0.028)、IL-4(3.17±1.19vs2.45±0.43，P<0.001)、IL-6(3.88±2.08vs2.33±0.88，P<0.001)、IL-10(3.64±1.73vs2.54±1.08，P=0.008).Th2 cytokines levels were significantly higher,the difference was statistically significant(P<0.05).④No statistically significant relationships was found between Treg and IFN-γ，TNF-a，IL-2，IL-6(P>0.05).Treg levels were negatively correlated with Th1/Th2(P=0.003)，but were positively correlated with IL-4 and IL-10(P<0.05).Conclusion The levels of CD4+CD25+regulatory T cells and Th2 cytokines were increased and Th1 cytokines levels were decreased in peripheral blood of advanced lung cancer patients.They may be together led to immune suppression and tumor progression in lung cancer patients.Monitoring the change of these indicators was very helpful for judging the curative effect and prognosis.It may be a new strategy to lung cancer to adjust the level of CD4+CD25+regulatory T cells and Th1/Th2 cytokines.

Lung neoplasms;CD4+CD25+regulatory T cells;Th1 and Th2 cytokines；Immunesuppression

?？谑兄攸c科技計劃項目(編號：2014-084)

570208 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院，?？谑腥嗣襻t(yī)院

程小珍

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.03.009

R734.2

A

1001-5930(2017)03-0378-04

2016-12-28

2017-02-14)