張玉虹 孫喜斌 劉 博

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宮頸癌組織中KLF4表達(dá)與外周血KLF4水平的相關(guān)性分析

張玉虹 孫喜斌 劉 博

目的 探討宮頸癌組織中和外周血KLF4水平的表達(dá)及其相關(guān)性。方法 選擇120例宮頸癌患者和健康成年女性30例，采用免疫組化SP法檢測宮頸組織中KLF4的表達(dá)，并采用半定量PCR檢測外周血KLF4的表達(dá)水平。結(jié)果 正常宮頸組織中KLF4表達(dá)陽性率最高(100.00%)，隨著宮頸癌臨床分期的增加，KLF4表達(dá)陽性率呈下降趨勢，Ⅳ期宮頸癌其陽性率僅為14.29%(P<0.05)。外周血中KLF4的表達(dá)水平對照組最高(0.78±0.35)，其表達(dá)水平隨著宮頸癌臨床分期的增加而逐漸下降，Ⅳ期宮頸癌降至最低(0.06±0.02)(P<0.01)。癌組織中KLF4表達(dá)與外周血KLF4水平呈正相關(guān)關(guān)系,γ=0.75(P<0.01)。兩者均與腫瘤臨床分期呈負(fù)相關(guān)性,γ分別為-0.64、-0.92(P<0.01)。結(jié)論 KLF4在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用，有望成為預(yù)測宮頸癌發(fā)生及預(yù)后評估的參考指標(biāo)。

宮頸癌；KLF4；免疫組織化學(xué)；外周血

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:354～357)

宮頸癌是女性常見的惡性生殖系統(tǒng)腫瘤，死亡率占發(fā)展中國家女性惡性腫瘤之首，且其發(fā)病在近年呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。宮頸癌的病因比較明確，其發(fā)生發(fā)展與人乳頭瘤狀病毒(HPV)持續(xù)性感染密切相關(guān)[2]，與生殖道黏膜感染有關(guān)的HPV有超過30種，HPV在女性中的感染率高達(dá)80%[3]。宮頸癌在早期發(fā)現(xiàn)并及時治療的情況下治愈率可以達(dá)到90%[4]，因此進行宮頸癌篩查對于防治宮頸癌有非常重要的臨床意義。Kruppel樣因子-4(kruppel-like factor 4，KLF4) 是1種具有特定結(jié)合位點的真核鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)與腫瘤相關(guān)，對于不同的靶基因具有抑制或激活的雙重作用[5]。包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征之一是凋亡抑制和失控性增殖，KLF4在細(xì)胞分化、增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用，是1種癌基因或抑癌基因。本研究通過分析宮頸癌患者的宮頸組織和外周血中KLF4的表達(dá)水平及其相關(guān)關(guān)系，為探討宮頸癌的早期診斷和預(yù)后評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇本院2015年1月至2016年3月收治的120例宮頸癌病例為研究對象(研究組)，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診?；颊吣挲g26～76歲，平均(47.93±7.52) 歲。組織病理學(xué)分型：鱗癌98例(81.67%) 、腺癌22例(18.33%) 。按WHO細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn)：高分化23例(19.17%)、中分化68例(56.67%)、低分化29例(24.16%) 。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的臨床分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期29例(24.17%) 、Ⅱ期41例(34.17%) 、Ⅲ期36例(30.00%)，Ⅳ期14例(11.66%)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例(40.83%)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例(59.17%)。入組前均未接受過化學(xué)治療或放射治療。另選擇未患宮頸癌的健康成年女性30例作為對照，對照組年齡為28～65歲，平均(45.86±6.94)歲，研究組和對照組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究在知情同意下進行，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

兔抗人KLF4多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，SP 染色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色劑購自北京中山生物技術(shù)開發(fā)有限公司，細(xì)胞總RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Therom公司。

1.3 研究方法

1.3.1 宮頸組織中KLF4表達(dá)檢測 對活檢獲得的宮頸組織標(biāo)本使用10%福爾馬林液固定，挑選有代表性的腫瘤組織的區(qū)域，石蠟包埋，制成切片。采用SP 法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作?？贵w工作濃度為1∶200。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知KLF4 陽性染色切片作為陽性對照。對照組使用正常兔血清作為替代試驗,結(jié)果均為陰性。呈陽性染色的KLF4一般為分布在細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色顆粒。采用盲法，由兩名病理科醫(yī)師按照染色強度與腫瘤細(xì)胞顯色的比例，對KLF4的表達(dá)情況進行半定量判定。根據(jù)顯色程度評分：1分為弱染色；2分為中等染色；3分為強染色。根據(jù)陽性細(xì)胞率評分：2分為陽性細(xì)胞數(shù)在11%～50%；3分為陽性細(xì)胞數(shù)在51%～80%；4分為為陽性細(xì)胞數(shù)>80 %。最終評級根據(jù)上述兩種評分之和分級:不考慮顯色強度，陽性細(xì)胞率≤10 %即為陰性(-)；3～5分為弱陽性(+)；6～7分則為強陽性(++)。

1.3.2 外周血KLF4檢測 抽取外周血5 ml，以3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min，分離血漿。參照細(xì)胞總RNA 提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，以總RNA 中的mRNA 作為模板，嚴(yán)格按照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit 說明書，將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用半定量RT-PCR 方法檢測KLF4 mRNA 的表達(dá)。KLF4 上游引物為5’-ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC-3’，下游引物為5’-GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT-3’，PCR 擴增時設(shè)內(nèi)參照基因。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，延伸72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。以2%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，對PCR 產(chǎn)物條使用Quantity One軟件進行灰度值分析，以目標(biāo)基因的PCR產(chǎn)物灰度值除以內(nèi)參基因值，所得的結(jié)果即為KLF4蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 基本情況

120例宮頸癌患者的年齡、病理學(xué)分型、細(xì)胞分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等基本情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 KLF4在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)情況

正常宮頸組織中KLF4蛋白表達(dá)的陽性率為100.00%，Ⅰ期宮頸癌組織中KLF4陽性率為89.64%，Ⅱ期宮頸癌組織中KLF4陽性率為65.85%，Ⅲ期宮頸癌組織中KLF4陽性率為47.22%，而Ⅳ期宮頸癌組織中KLF4陽性率最低，僅為14.29%。隨著宮頸癌臨床分期的增加，KLF4陽性率呈逐漸下降趨勢，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=48.68，P<0.01)，見表2。

2.3 外周血KLF4半定量RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示：KLF4mRNA表達(dá)水平在正常對照組中最高，為(0.78±0.35)，隨著宮頸癌臨床分期的增加，其mRNA表達(dá)水平逐步下降，至Ⅳ期宮頸癌下降至最低，僅為(0.06±0.02)，各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。高分化宮頸癌組織中KLF4mRNA表達(dá)水平最高，為(0.51±0.29)，隨著細(xì)胞分化水平的下降，其mRNA表達(dá)水平逐步下降，低分化下降至最低，僅為(0.09±0.03)，相互間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表1 宮頸癌患者的基本情況(例，%)

表2 KLF4在不同臨床分期宮頸癌組織和正常宮頸組織中表達(dá)情況(例，%)

表3 宮頸癌患者外周血中KLF4表達(dá)水平與其臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 宮頸癌組織中KLF4表達(dá)與外周血中KLF4表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示：宮頸癌組織中KLF4水平和外周血KLF4水平均隨著宮頸癌臨床分期的增加而下降，兩者均與臨床分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)γ分別為-0.64(P<0.01)和-0.92(P<0.01)。而癌組織中KLF4水平與外周血KLF4水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)γ為0.75(P<0.01)。

3 討論

KLF4是真核生物中1種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，包含3個結(jié)構(gòu)域：高度可變的N端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及核定位序列，高度保守的C端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合靶基因富含Gc的啟動子序列，促進或抑制靶基因的表達(dá)[6]。KLF4在口腔、食管上皮、內(nèi)皮細(xì)胞和消化道等處表達(dá)豐富，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和維持正常組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[7]。KLF4是具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的雙重功能轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)靶基因的不同，KLF4可對下游靶基因起到激活作用或抑制作用，已逐漸成為腫瘤研究中的熱點。研究顯示，KLF4在不同腫瘤中可分別發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用。KLF4在胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌中呈低表達(dá)，表現(xiàn)抑癌基因功能，能抑制腫瘤細(xì)胞生長，阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制腫瘤的侵襲和遷移[8-9]；而在乳腺癌和口腔癌中則呈高表達(dá)，表現(xiàn)癌基因的特點，促進腫瘤的發(fā)展、浸潤與轉(zhuǎn)移[10]。

宮頸癌的發(fā)生與人類乳頭狀瘤病毒密切相關(guān)。在病毒感染和相關(guān)的環(huán)境影響下，往往經(jīng)歷了從慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸癌的多階段的進展惡化過程。KLF4 的表達(dá)下調(diào)可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)。楊文婷等[11]研究了30例正常宮頸、28 例宮頸原位癌和39 例宮頸鱗癌組織中KLF4 蛋白的表達(dá)關(guān)系，結(jié)果顯示KLF4 蛋白在正常宮頸組織與宮頸原位癌中的表達(dá)均為陽性，而在宮頸鱗癌組織中表達(dá)明顯下降下調(diào)(P<0.05)，提示KLF4 可能作為1個抑癌基因影響著宮頸癌的發(fā)生。本研究通過對不同臨床分期的宮頸癌和正常宮頸組織的KLF4表達(dá)情況進行分析，結(jié)果與類似研究比較一致[11-12]。KLF4陽性率在正常宮頸組織的陽性率達(dá)到100%，而隨著宮頸癌臨床分期的增加，KLF4陽性率呈下降趨勢，至Ⅳ期宮頸癌陽性率最低，僅為14.29%，各組的KLF4陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。KLF4發(fā)揮抑癌作用的機制可能是通過上調(diào)p27Kip1蛋白表達(dá)，從而使細(xì)胞周期停滯在G1/S期而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[13]。本研究分析了不同臨床分期的宮頸癌病例和正常對照組外周血KLF4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與宮頸組織一致，外周血KLF4在正常對照組中最高，隨著臨床分期的增加，其表達(dá)水平逐步下降，至Ⅳ期宮頸癌下降至最低，各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 Yang的研究顯示[13]，低分化細(xì)胞宮頸癌的宮頸組織KLF4 陽性率低于高、中分化宮頸癌。本研究則表明高分化組外周血中KLF4水平最高，隨細(xì)胞分化水平下降，其表達(dá)水平逐步下降，至低分化組降至最低(P<0.01)，這也提示了KLF4在宮頸癌的細(xì)胞分化過程中可能起著重要作用。而且本研究相關(guān)分析顯示，癌組織KLF4水平與外周血KLF4水平為同向變化，呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，而兩者與臨床分期均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

綜上所述，本研究提示KLF4在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能通過抑制細(xì)胞增殖和遷移而發(fā)揮抑癌作用，其在宮頸組織或外周血中的表達(dá)缺失可能促進了癌組織的進展。宮頸組織或外周血中KLF4的檢測可能成為宮頸癌的預(yù)測和預(yù)后評估的新的參考指標(biāo)，對宮頸癌的早期診斷及良好預(yù)后可能有積極的作用。

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(編輯：吳小紅)

Correlation Analysis of Expression of KLF4 in Cervical Carcinoma Tissue with KLF4 in Peripheral Blood

ZHANG Yuhong,SUN Xibin,LIU Bo.

The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,075000

Objective To probe the expression of KLF4 in cervical carcinoma tissue and KLF4 level in peripheral blood and their correlation.Methods A total of 120 patients with cervical carcinoma and 30 healthy women were chosen.The expression of KLF4 in cervical tissues was examined by SP immunohistochemicalstaining and levels of KLF4 in peripheral blood were measured by semi-quantitative RT-PCR.Results The positive expression rate of KLF4 in normal cervical tissues was the highest(100.00%)，and the positive espression rate decreased gradually with the increasing of clinical classification of cervical cancer.The positive rate of patients with IV phase cervical cancer was only 14.29%(P<0.05).KLF4 level in peripheral blood was the highest in normal controls (0.78±0.35),and its level decreased with the increasing of clinical classification of cervical cancer.The level of patients with IV phase cervical cancer was the lowest(0.06±0.02)(P<0.01).There was strong positive correlation between KLF4 in cervical tissue and KLF4 in peripheral blood(γ=0.75,P<0.01),and both of them were negatively correlated with cervical carcinoma clinical classification,r was -0.64 and -0.92 respectively (P<0.01).Conclusion KLF4 plays the role of tumor suppressing in the development of cervical cancer，which is expected to be a new reference indicator to predict the occurrence of cervical cancer and the prognosis of patients.

Cervical carcinoma;KLF4;Immunohistochemistry;Peripheral blood

2016年度河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(編號：20160376)

075000 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.03.002

R737.33

A

1001-5930(2017)03-0354-04

2016-06-07

2017-01-12)