陳干濤 董衛(wèi)國

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·基礎(chǔ)研究·

羥喜樹堿通過誘導自噬抗宮頸癌的機制研究

陳干濤 董衛(wèi)國

目的 探討抗腫瘤藥物羥喜樹堿(HCPT)對宮頸癌HeLa 細胞作用的機制。方法 CCK8檢測Hela細胞增殖，Western blot檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達，GFP-LC3 shRNA轉(zhuǎn)染和Hoechst染色后，熒光顯微鏡下觀察細胞自噬特異小體量的改變以及凋亡形態(tài)學的變化。結(jié)果 HCPT抑制Hela細胞生長呈濃度依賴性(P<0.05)，IC503 μmol/L HCPT作用Hela細胞后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62的表達以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值發(fā)生改變，差異有顯著性意義(P均<0.05)； 凋亡相關(guān)蛋白Bax 、cleaved caspase-3、Bcl-2表達也發(fā)生明顯改變(P均<0.05)；熒光顯微鏡下觀察Hela細胞帶有GFP-LC3的自噬體增加，凋亡細胞也增多(P均<0.05)。結(jié)論 HCPT能夠誘導HeLa 細胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、p62以及LC3 的表達增強，從而激活細胞自噬發(fā)生； 且HCPT能夠激活宮頸癌HeLa細胞發(fā)生自噬，進而誘導細胞凋亡來達到抗腫瘤目的。

羥喜樹堿；宮頸癌；自噬；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:349～353)

宮頸癌(cervical cancer)是影響女性健康最常見的惡性腫瘤之一。是女性生殖道最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率一直居高不下[1]，因此，尋求相應藥物進一步提高宮頸癌的治療效果具有重要的臨床意義，深入研究相關(guān)藥物治療宮頸癌及其細胞分子機制成為婦科腫瘤領(lǐng)域的研究重點。

自噬是真核細胞的1種非細胞凋亡性程序性死亡，又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。在生物的生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程中均有重要作用。營養(yǎng)缺乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激、細胞器損傷以及細胞死亡都可以激活自噬信號通路[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬在神經(jīng)退行性疾病、感染性疾病及腫瘤發(fā)生中扮演著重要作用。因此自噬現(xiàn)象可能成為包括宮頸癌在內(nèi)的腫瘤藥物治療的新靶點[4]。

羥喜樹堿(hydroxycamptothecin，HCPT)是唯一有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類特異性腫瘤化學治療藥物，能夠阻滯細胞于S期，目前在臨床上已廣泛應用，不良反應較小，在胃癌、肝癌、頭頸癌及白血病等惡性腫瘤的治療上已取得令人矚目的成就[5]，因此有望成為治療宮頸癌的又一“銳利武器”；但有關(guān)其在治療宮頸癌中的作用機制鮮有報道，本實驗旨在研究HCPT對宮頸癌代表細胞株-HeLa細胞在自噬方面的影響，從細胞信號傳導通路的角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系HeLa細胞購自中國科學院上海細胞庫；羥基喜樹堿(HCPT)購自美國Santa Cruz公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Life Technologies公司；GFP-LC3質(zhì)粒由南京醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院惠贈。Beclin-1,p62,LC-3B,GAPDH等抗體購自美國Santa Cruz公司;Bax,Bcl-2，cleaved caspase3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞計數(shù)法檢測細胞活力 采用細胞活力檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK8)法檢測細胞活力。以5 000個/孔的密度將HeLa接種于96孔培養(yǎng)板中，12 h后，分別加入1、2、4、6、8、10 μmol/L羥喜樹堿(用0.9%氯化鈉溶液溶解)，每濃度組設(shè)6個復孔，同時設(shè)立0.9%氯化鈉溶液作為陰性對照；置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，放置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應用ELX-800型酶標儀(美國Bio-Tek公司)測定各孔450 nm處的吸光度(a)值。細胞抑制率(%)=1-(用藥組a值/對照組a值)×100%。通過擬合函數(shù)曲線計算藥物處理的半數(shù)抑制濃度即IC50。

1.2.2 Western blot法檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達 將HeLa細胞均勻接種于60 mm培養(yǎng)皿中，藥物處理后用預冷的PBS洗3遍，加入含有100 mmol/L PMSF的裂解液(RIPA)裂解細胞,冰上放置30 min充分裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清液后經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。依次進行質(zhì)量分數(shù)10%SDS-PAGE凝膠電泳，使用PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，4 ℃封閉一抗過夜，TBST清洗3次(每次5 min)后加入相應二抗，室溫下孵育60 min，TBST洗3次后進行顯影，實驗重復3次，采用計算機軟件ImageJ分析灰度值并記錄。

1.2.3 細胞凋亡形態(tài)學變化的觀察 將HeLa細胞接種于六孔板中，每孔1×106，培養(yǎng)過夜，加入相應的藥物分別處理12和24 h，同時設(shè)立對照組；細胞經(jīng)PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，加入Hoechst33342(杭州碧云天生物科技有限公司)避光孵育10 min，PBS清洗3遍后，在熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察細胞核形態(tài)并統(tǒng)計記錄。

1.2.4 細胞自噬率檢測 將HeLa細胞接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜，使細胞密度達到60%～70%。通過Lipofectamine 2000(美國Life Technologies)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒體，6 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后加入羥基喜樹堿分別作用12 h和24 h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察對GFP-LC3的陽性自噬點數(shù)進行統(tǒng)計，統(tǒng)計對照組和處理組中單個細胞中GFP-LC3點熒光數(shù)，每組至少統(tǒng)計25個細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HCPT對HeLa細胞具有毒性作用

不同濃度的HCPT作用于HeLa細胞，結(jié)果表明，HCPT對細胞具有明顯的生長抑制作用(P=0.034)，見圖1。其IC50約為3 μmol/L。本實驗選取IC50即3 μmol/L濃度的HCPT探究其作用機制。

圖1 不同濃度HCPT對HeLa細胞的生長抑制作用

2.2 HCPT能夠誘導HeLa細胞自噬蛋白表達變化

給予HeLa細胞以3 μmol/L濃度的HCPT分別處理12 h和24 h，通過western blot檢測顯示，隨著HCPT作用后，自噬標記蛋白Beclin1表達量增加，而自噬底物標記蛋白p62出現(xiàn)降解，作為自噬發(fā)生指標的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也同樣表現(xiàn)出上升，差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.0087和0.009)，見圖2。Western blot結(jié)果表明，HCPT能夠引起HeLa細胞自噬，并隨藥物作用時間的延長自噬水平也出現(xiàn)升高。

注：A為Western blot檢測結(jié)果；B為Hela細胞中自噬蛋白的表達情況。

2.3 HCPT引起HeLa細胞中GFP-LC3點狀分布增加

GFP-LC3目前被認為是自噬體特異性標簽。是1種檢測自噬發(fā)生常用的實驗技術(shù)手段，將HeLa細胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3后，用HCPT分別處理12 h和24 h，在熒光顯微鏡下觀察并對帶有GFP-LC3的自噬點陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)進行統(tǒng)計，見圖3A。相對于對照組的細胞，HCPT能夠明顯增加細胞自噬體的數(shù)量(P值分別為0.018和0.008)，見圖3B。進一步證明了HCPT可以誘發(fā)HeLa細胞自噬發(fā)生。

注：A為熒光顯微鏡觀察HeLa細胞中GFP-LC3標記的自噬點；B為GFP-LC3標記的自噬點Hela細胞的陽性率。

2.4 HCPT誘導HeLa細胞凋亡的形態(tài)變化

給予HeLa細胞以3 μmol/L濃度的HCPT分別處理12 h和24 h，經(jīng)過固定，Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，24 h處理組細胞出現(xiàn)細胞核皺縮，染色加深等凋亡形態(tài)，而12 h小時組并未出現(xiàn)明顯細胞核變化，見圖4A。3 μmol/L 的HCPT在處理24 h細胞后可引發(fā)細胞凋亡(P=0.006)，而12小時作用并不明顯(P=0.079)，見圖4B。提示HCPT引發(fā)的細胞凋亡是在細胞出現(xiàn)自噬后所引起的。

注：A為熒光顯微鏡觀察Hela細胞凋亡情況；B為不同組Hela細胞凋亡率。

2.5 HCPT誘導HeLa細胞凋亡相關(guān)蛋白變化

為進一步證實HCPT所引發(fā)的細胞凋亡現(xiàn)象，通過Western blot方法檢測了細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化。在細胞處理24 h組中，細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達量上升(P=0.025)，cleaved Caspase-3的表達量也增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達出現(xiàn)下降(P=0.018 )。而在12 h處理組中，上述蛋白并未出現(xiàn)明顯變化，見圖5A～5B。Western blot結(jié)果進一步證實了HCPT引發(fā)的細胞凋亡是跟隨細胞自噬發(fā)生后出現(xiàn)的。

注：A為Western blot 檢測結(jié)果；B為抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況；C為凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達情況。

3 討論

羥喜樹堿是從我國特有的珙垌科植物喜樹中分離提取出的五環(huán)生物堿，是唯一具有選擇性抑制DNA Topo I作用的植物類抗腫瘤藥，目前已廣泛應用于臨床。近來國內(nèi)外已進行大量的研究發(fā)現(xiàn)羥喜樹堿作用穩(wěn)定且不良反應小，可有效誘導多種腫瘤細胞和部分非腫瘤細胞的凋亡[6]。宮頸癌發(fā)病率高，目前臨床治療效果較好，但最近幾年治療方法上沒有突破，處于瓶頸期。因此，追尋新的方法來提高宮頸癌的治療效果迫在眉睫[7]。

在本實驗研究中，通過Western blot和GFP-LC3 shRNA轉(zhuǎn)染細胞等檢測方法，首次發(fā)現(xiàn)HCPT作用于HeLa細胞后能夠引發(fā)自噬，并且隨著作用時間的延長，其自噬水平成增強趨勢。本實驗所選取的自噬指標蛋白中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3，LC 3)是目前研究較多的自噬標志性物質(zhì)，其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，被認為是自噬特異性形成指標[8]；而另一種蛋白-Beclin1是哺乳動物的自噬調(diào)控基因，是自噬發(fā)生的觸發(fā)器，其表達的上調(diào)可誘導自噬的形成，兩種自噬指示蛋白在HCPT的作用下，均出現(xiàn)表達量增加[3]。一些研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，自噬相關(guān)蛋白的表達被抑制，從而下調(diào)了自噬的形成，造成腫瘤的不斷生長，另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，當自噬相關(guān)蛋白過表達后，宮頸癌細胞的生長會受到明顯抑制[9-10]，因此，通過誘導自噬形成有可能成為未來宮頸癌治療的策略之一。

同時，除了能夠增加細胞的自噬外，我們通過Western blot以及Hoechst染色也證實了HCPT還可以引起細胞凋亡，并且凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)在自噬發(fā)生之后，說明HCPT作用于細胞后，首先引起細胞自噬水平的升高，進而觸發(fā)細胞凋亡信號的啟動，最終導致腫瘤細胞死亡，達到抗腫瘤的目的。

很多研究發(fā)現(xiàn)，自噬與凋亡的機制之間關(guān)系復雜，存在著許多重疊的部分。一些觀點則認為自噬是凋亡必需的，當自噬受到抑制時會延緩凋亡的發(fā)生，而自噬水平的升高往往會導致細胞凋亡通路的激活。本實驗的研究證實，在宮頸癌細胞中，HCPT的抗腫瘤的機制是首先通過激活細胞自噬，進而觸發(fā)細胞凋亡，從而達到其抗腫瘤的目的，這提示自噬和凋亡程序密不可分。同樣，其他類似的研究也發(fā)現(xiàn)，順鉑作用HeLa細胞后，自噬小體形成數(shù)增加，自噬蛋白Beclin1和LC3表達量也增加，同時激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激—自噬反應參與了順鉑對宮頸癌細胞的細胞毒性作用[11-12]。由于自噬與凋亡之間仍然存在著很多不明之處，因此，仍需要今后進行大量、細致的研究來探討。

而自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要通路，在疾病中的作用逐步得到認同。我們的研究首次表明了HCPT在抗宮頸癌發(fā)生過程中的機制問題，是通過激活細胞自噬(還有可能是通過激活自噬誘導宮頸癌細胞凋亡)從而抑制宮頸癌細胞的生長，最終導致細胞死亡，為HCPT在治療宮頸癌方面提供了理論基礎(chǔ)，也為開發(fā)類似藥物提供了新的思路。

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(編輯：吳小紅)

Antitumor Mechanism of Hydroxycamptothecin on Cervical Cancer byInducing Cell Autophagy

CHEN Gantao,DONG Weiguo.

Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430062

Objective To investigate the antineoplastic mechanism of hydroxycamptothecin (HCPT) on cervical cancer HeLa cell line.Methods CCK8,western blot and fluorescence microscopy were used to detect cellular morphology,autophagy-related proteins and apoptosis-related proteins and the volume and shape of autophagosome after the Hela cell was treated with HCPT,and being transfected with GFP-LC3 shRNA and stained by Hoechst.Results HCPT inhibited the growth of Hela cells in a concentration-dependent manner (P<0.05) with IC503μmol/L.After 3μmol/L HCPT being used on Hela cells,the expression of autophagy-related proteins Beclin1 and p62 were heighten obviously and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio was changed apparently(P<0.05).The expression of apoptosis-related proteins Bax,cleaved caspase-3 and Bcl-2 were also varied significantly (P<0.05).HeLa cells with GFP-LC3 showed an increase of autophagy and apoptotic cells observed by fluorescence microscopy(P<0.05).Conclusion HCPT could induce the expression of autophagy-related genes Beclin1,p62 and LC3,thereby to activate cellular autophagy and apoptosis.Besides,HCPT could activate the autophagy in cervical cancer HeLa cells,thereby inducing the apoptosis to achieve the purpose of anti-tumor.

Hydroxycamptothecin(HCPT);Cervical cancer;Autophagy;Apoptosis

湖北省衛(wèi)生廳項目(編號：2012Z-Y02)；湖北省衛(wèi)計委一般面上項目(編號：WJ2015MB084)

430060 武漢大學人民醫(yī)院(陳干濤，董衛(wèi)國)；433000 湖北省仙桃市第三人民醫(yī)院(陳干濤)

董衛(wèi)國

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.03.001

R737.33

A

1001-5930(2017)03-0349-05

2016-05-04

2016-11-15)