張 莉，倪孟祥

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

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海洋放線菌AM8發(fā)酵條件的優(yōu)化及抑菌活性物質(zhì)的初步研究

張 莉，倪孟祥*

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

以海洋放線菌AM8發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的活性為評價指標(biāo)，采用單因素實驗對海洋放線菌AM8的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對抑菌活性物質(zhì)進行了初步研究。確定最佳培養(yǎng)基為：胰蛋白胨17 g·L-1，大豆胨3 g·L-1，蔗糖2.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，K2HPO42.5 g·L-1，海鹽20 g·L-1；最佳發(fā)酵條件為：pH值7，溫度28 ℃，接種量5%，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵時間5 d。該抑菌活性物質(zhì)為中等極性物質(zhì)，具有良好的耐酸性和一定的熱穩(wěn)定性，在強堿、高溫環(huán)境下易失活。

放線菌AM8；發(fā)酵條件；優(yōu)化；抑菌活性物質(zhì)

自Waksmanfa發(fā)現(xiàn)鏈霉菌以來，以抗生素生產(chǎn)、研究為首的現(xiàn)代技術(shù)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。但由于傳統(tǒng)陸生來源的抗菌微生物和抗生素的大量重復(fù)分離，極大阻礙了尋求新型有效生物活性物質(zhì)的進程[1]。隨著廣泛篩選和活性物質(zhì)的重復(fù)發(fā)現(xiàn)，以及近年來臨床病原微生物和耐藥病原菌數(shù)量的急劇增加，迫切需要我們開發(fā)新型有效的抗生素。

海洋是生命的起源，蘊藏全球80%以上的物種，是包括未培養(yǎng)微生物在內(nèi)的珍貴寶庫[2]。海洋具有復(fù)雜多樣的生態(tài)環(huán)境，海洋微生物相對于土壤微生物，更能耐受高壓、高鹽、低光照、低氧等特殊生存條件，具有遺傳、種類及生態(tài)功能的多樣性，是目前新型微生物及活性化合物的重要來源[3-4]。最新藥物發(fā)現(xiàn)趨勢顯示，海洋極端環(huán)境可能存在產(chǎn)生特有代謝產(chǎn)物的放線菌群，是開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎的微生物天然產(chǎn)物的潛力來源。目前已有2/3左右的活性物質(zhì)在海洋放線菌中被發(fā)現(xiàn)，而80%活性物質(zhì)分離自海洋鏈霉菌，其分子結(jié)構(gòu)獨特新穎，化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣，是土壤鏈霉菌所不具有的[5-6]。海洋放線菌是海洋微生物中研究最多的群體，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化工、能源再生、污染治理等領(lǐng)域[7-8]。近年來關(guān)于海洋放線菌為新的天然產(chǎn)物的報道逐漸增多，并且有些化合物已進入臨床試驗階段[9]，開發(fā)海洋放線菌資源、尋找新型活性化合物成為當(dāng)前研究的熱點[10-11]。海洋放線菌AM8發(fā)酵液的抑菌活性較強且抗菌譜較廣。

海洋放線菌AM8發(fā)酵液對耐藥菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus epidermidis，MRSE)的抑制效果顯著，對革蘭氏陽性細菌(gram-positivebacteria，G+)：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)的抑制效果明顯，對革蘭氏陰性細菌(gram-negativebacteria，G-)：大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑制作用較弱，但表現(xiàn)出一定的抗黑曲霉(Aspergillus niger)活性。鑒于海洋放線菌AM8次級代謝產(chǎn)物較高的抑菌活性，為提高海洋放線菌AM8次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，有必要對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為后續(xù)次級代謝產(chǎn)物的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定積累足夠的化合物。作者以海洋放線菌AM8發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)對MRSA的抑制效果為評價指標(biāo)，優(yōu)化基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，初步研究抑菌活性物質(zhì)，以提高菌株產(chǎn)活性物質(zhì)的產(chǎn)率。

1 實驗

1.1 菌種

海洋放線菌AM8(從海泥中分離篩選獲得)、MRSA，均保藏于中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物制藥教研室。

1.2 儀器

Allegra 25R 型高速冷凍離心機，美國Beckman公司；電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R型壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠 ；QHZ-98A型全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉華美生化儀器廠；GHX-9080B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；HH-S11.2型恒溫水浴鍋，江蘇東臺電器廠。

1.3 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基(高氏一號液體培養(yǎng)基)(g·L-1)：可溶性淀粉20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01。固體培養(yǎng)基添加瓊脂20。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基A(g·L-1)：黃豆粉25，可溶性淀粉20，(NH4)2SO42，NaCl 2，K2HPO40.5，CaCO35，海鹽20，pH值7.2。

培養(yǎng)基B(g·L-1)：胰蛋白胨17，大豆胨3，葡萄糖2.5，NaCl 5，K2HPO42.5，海鹽20，pH值7.1～7.5。

培養(yǎng)基C(g·L-1)：蛋白胨15，黃豆粉5，可溶性淀粉15，甘油1.5，CaCO32，海鹽20，pH值7.8。

培養(yǎng)基D(g·L-1)：葡萄糖10，蛋白胨3，小米10，NaCl 2.5，CaCO32，海鹽20，pH值7.2～7.4。

培養(yǎng)基E(g·L-1)：葡萄糖4，酵母提取物4，麥芽提取物10，CaCO32，海鹽20，pH值7.2。

培養(yǎng)基F(g·L-1)：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，KNO31，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，酵母粉5，海鹽20，pH值7.4～7.6。

指示菌培養(yǎng)基(g·L-1)：酪蛋白水解物17.5，淀粉1.5，牛肉浸粉5，瓊脂20，pH值7.2。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵液的制備

將甘油管保存的海洋放線菌AM8接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d。挑取單菌落接種于裝有50 mL種子液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)3 d，即得種子液(期間可不斷接種以獲取新的種子液)。按1%的接種量將種子液接種于裝有150 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5 d，收集濾液，即得發(fā)酵液。

1.4.2 抑菌活性的測定

取生長24 h的MRSA斜面，用2 mL生理鹽水懸浮，取20 μL菌懸液加入新鮮配制保溫于45 ℃恒溫水浴的25 mL指示菌培養(yǎng)基中，其濃度約為1×106CFU·mL-1。離心，取上清液用無菌的0.22 μm微孔濾膜過濾，以MRSA為指示菌，采用管碟法測定抑菌物質(zhì)的活性。加入量為150 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，每組實驗平行測3次，以每組抑菌圈直徑的平均值作為抑菌活性評價指標(biāo)。

1.4.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

將種子液按1%的接種量分別接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基A～F，于28 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5 d。收集各發(fā)酵液于8 000 r·min-1離心20 min，得發(fā)酵上清液，測定抑菌活性。

1.4.4 培養(yǎng)基成分的篩選

采用單因素實驗分別對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽進行篩選。于28 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5 d，過濾，收集濾液測定抑菌活性。

1.4.5 發(fā)酵條件的篩選

將種子液按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的接種量接入到裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的三角瓶中，分別調(diào)節(jié)其初始pH值為4、5、6、7、8、9，于28 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5 d，過濾，收集濾液測定抑菌活性。

1.4.6 發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性的測定

取120 mL發(fā)酵上清液，平均分成12份，分別調(diào)節(jié)pH值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再將各份五等分置于5 mL EP管中，分別置于4 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴2 h，觀察抑菌圈產(chǎn)生情況，測量抑菌圈直徑。

1.4.7 發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)極性的測定

取120 mL發(fā)酵上清液，平均分成12份，分別調(diào)節(jié)pH值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再將各份五等分置于5 mL EP管中，分別加入等體積的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、石油醚，并編號。于4 ℃靜置至完全分層后分別取有機相與水相(pH值調(diào)回中性)，以原發(fā)酵上清液為對照、以MRSA為指示菌進行抑菌活性的測定，觀察有機相與水相的抑菌圈產(chǎn)生情況，測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選(圖1)

圖1 不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖1可以看出，在培養(yǎng)基B中發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高。因此，選擇培養(yǎng)基B作為海洋放線菌AM8的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行接下來的優(yōu)化實驗。

2.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、無機鹽的篩選

2.2.1 碳源的篩選

以原培養(yǎng)基中的葡萄糖作為對照，分別考察蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、木糖、可溶性淀粉、甘油對發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 碳源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖2可以看出，以蔗糖為碳源時，發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高，其次是葡萄糖、乳糖和甘露醇，木糖最低。因此，選擇蔗糖作為碳源。

2.2.2 氮源的篩選

以原培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源胰蛋白胨+大豆胨作為對照，分別考察NaNO3、胰蛋白胨、大豆胨、NH4Cl、尿素、蛋白胨、酵母粉、黃豆粉對發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 氮源對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖3可以看出，以原復(fù)合氮源胰蛋白胨+大豆胨為氮源時，發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高，其次是NaNO3，海洋放線菌AM8幾乎不能利用尿素和酵母粉。因此，選擇原復(fù)合氮源胰蛋白胨+大豆胨。2.2.3 無機鹽的篩選

以原培養(yǎng)基中的復(fù)合無機鹽NaCl+K2HPO4作為對照，分別考察MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3對發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 無機鹽對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖4可以看出，添加等量的不同無機鹽對發(fā)酵液抑菌活性的影響不大，5種無機鹽所培養(yǎng)的菌株的發(fā)酵液抑菌活性都比較高，其中原復(fù)合無機鹽的抑菌活性相對最高。因此，選擇原復(fù)合無機鹽NaCl+K2HPO4。

2.3 發(fā)酵條件的篩選

2.3.1 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響(圖5)

圖5 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖5可以看出，接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響呈一定的規(guī)律，接種量過少或過多都會影響抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生；接種量為5%時，發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高。因此，選擇接種量為5%。

2.3.2 pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響(圖6)

圖6 pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖6可以看出，pH值為7時發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高；pH值為8時抑菌活性有所下降。因此，在發(fā)酵時應(yīng)保證發(fā)酵液的pH值為中性，過酸或過堿都不利于抑菌活性物質(zhì)的積累。

2.4 發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的研究

2.4.1 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性(圖7)

圖7 抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性

由圖7可以看出，發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)在偏酸性條件下活性較高且穩(wěn)定，由于不同pH值的水溶液對照均無抑菌圈產(chǎn)生，所以排除pH值本身不同造成的影響。在偏酸性條件下，經(jīng)過60 ℃以下處理的發(fā)酵液抑菌活性相差不大，但是經(jīng)過80 ℃以上處理后抑菌活性明顯降低。因此，強堿、高溫條件容易導(dǎo)致發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)失活。

2.4.2 抑菌活性物質(zhì)的極性(圖8)

圖8 不同萃取劑在不同pH值下萃取的有機相的抑菌活性

由圖8可以看出，石油醚和正丁醇萃取后的有機相的抑菌圈直徑重合于橫坐標(biāo)軸，說明發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)不溶于石油醚和正丁醇；抑菌活性物質(zhì)在二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中有一定的溶解性，但其抑菌活性均低于原發(fā)酵液，說明有機溶劑萃取法提取活性物質(zhì)會造成一定的損失。

實驗發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿萃取后的水相仍有一定的抑菌活性，這是因為實驗過程只萃取一次，會存在明顯的萃取不完全的情況；石油醚和正丁醇萃取后的水相抑菌活性均較高，進一步驗證了抑菌活性物質(zhì)不溶于石油醚和正丁醇，說明該物質(zhì)為中等極性；在強堿條件下不易溶于有機溶劑，說明該物質(zhì)在強堿條件下不穩(wěn)定，易被降解。

3 結(jié)論

對海洋放線菌AM8的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對抑菌活性物質(zhì)進行初步研究。確定最佳培養(yǎng)基為：胰蛋白胨17 g·L-1，大豆胨3 g·L-1，蔗糖2.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，K2HPO42.5 g·L-1，海鹽20 g·L-1；最佳發(fā)酵條件為：pH值7，溫度28 ℃，接種量5%，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵時間5 d。該抑菌活性物質(zhì)為中等極性物質(zhì)，具有良好的耐酸

性和一定的熱穩(wěn)定性，在強堿、高溫環(huán)境下易失活。該研究為進一步研究海洋放線菌AM8次級代謝產(chǎn)物奠定了理論基礎(chǔ)。

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《化學(xué)與生物工程》編輯部

Optimization on Fermentation Conditions of MarineActinomyceteAM8 and Preliminary Study on Antibacterial Active Substance

ZHANG Li,NI Meng-xiang*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

UsingtheactivityofantibacterialsubstanceofthefermentationbrothfrommarineActinomyceteAM8asanindex，asinglefactorexperimentwasusedtooptimizethebasicfermentationculturemediumandfermentationconditions.Theantibacterialactivesubstanceofthefermentationbrothwaspreliminarilystudied.Theoptimalculturemediumwasasfollows:tryptone17g·L-1,soybeanpeptone3g·L-1,sucrose2.5g·L-1,NaCl5g·L-1,K2HPO42.5g·L-1,andseacrystal20g·L-1.Theoptimalfermentationconditionswereasfollows:pHvalue7,temperature28 ℃,inoculum5%,shakingspeed200r·min-1,andfermentationtime5d.Theantibacterialactivesubstancewasmediumpolaritysubstance,whichhadgoodacidresistanceandcertainthermalstability,andeasilybecameinactivatedunderstrongalkalisandhightemperatureconditions.

AntinomyceteAM8;fermentationcondition;optimization;antibacterialactivesubstance

2017-01-03

張莉(1992-)，女，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：zldyxzl@126.com；通訊作者：倪孟祥，副教授，E-mail：nimx-2000@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.011

TQ920.6

A

1672-5425(2017)06-0051-05

張莉，倪孟祥.海洋放線菌AM8發(fā)酵條件的優(yōu)化及抑菌活性物質(zhì)的初步研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：51-55.