鄧春梅，何蘭珍，張國(guó)光，李思東，溫燕梅，吳育廉，黃燈威，康信煌

(廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088)

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紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

鄧春梅，何蘭珍，張國(guó)光，李思東，溫燕梅，吳育廉，黃燈威，康信煌*

(廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088)

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，用Sevage試劑脫蛋白并純化多糖，用DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力評(píng)價(jià)多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取工藝為：提取溫度75 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此條件下，多糖提取率達(dá)到3.14%；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，多糖清除DPPH自由基的能力及總抗氧化能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。表明紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖是一種天然抗氧化劑。

紅樹(shù)林；土曲霉；多糖；提??；抗氧化活性

紅樹(shù)林是生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶海岸灘涂上的特殊森林植物，是陸地向海洋過(guò)渡的特殊生態(tài)系，兼具海洋與陸地的性質(zhì)[1-2]，具有豐富獨(dú)特的真菌資源。紅樹(shù)林共附生真菌能產(chǎn)生許多藥用活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，是崛起的一類新型藥用真菌[3-8]。作者[9-10]前期研究發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B能產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物以及新的活性化合物。在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步提取其中的多糖，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并研究多糖的體外抗氧化活性，以期擴(kuò)大紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B的藥用范圍、提高其藥用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與儀器

紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B：GenBankID為KC461499。

蒽酮、丙酮、濃硫酸、30%雙氧水等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭惺邸?/p>

80-2B型離心沉淀機(jī)，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司； 722S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司； 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化設(shè)備公司；小型粉碎機(jī)；水浴搖床；三用恒溫水箱。

1.2 菌種的培養(yǎng)

將紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B接種于GPY培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)28d，過(guò)濾，分離菌體與培養(yǎng)液；將菌體在甲醇中浸泡清洗3次后取出，自然晾干，待用。

1.3 多糖的提取與純化

紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的提取與純化工藝：菌體粉碎→熱水提取→旋轉(zhuǎn)濃縮→加入95%乙醇，冰箱靜置過(guò)夜→離心→干燥→粗多糖→溶解→Sevage法[11]脫蛋白→離心→取上清液→加95%乙醇，冰箱靜置過(guò)夜→離心→干燥→多糖。

1.4 多糖提取率的計(jì)算

參照文獻(xiàn)[12]，采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定多糖溶液在490nm處吸光度(A490)，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，再按式(1)計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：D490為多糖含量；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積；m為菌體質(zhì)量。

1.5 多糖抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

用移液槍取2.8 mL 1.0 mg·mL-1多糖溶液于24孔板中；再用移液槍從中移取1.4 mL多糖溶液于下一個(gè)孔中，加蒸餾水1.4 mL，混勻；再?gòu)闹腥?.4 mL多糖溶液于下一個(gè)孔中，按此法稀釋得到5個(gè)梯度濃度多糖溶液，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，空白對(duì)照為1.4 mL蒸餾水與1.4 mL無(wú)水乙醇混合液；然后用移液槍取1.4 mL 0.2 μmol·L-1DPPH溶液于多糖溶液及空白對(duì)照中，快速混勻，在黑暗中反應(yīng)30 min后測(cè)定517 nm處吸光度，按式(2)計(jì)算清除率。

(2)

式中：A0為無(wú)水乙醇+DPPH溶液的吸光度；A1為多糖+DPPH溶液的吸光度。

1.5.2 總抗氧化能力的測(cè)定

稱取6.1 mg FeSO4，配成水溶液；加入0.25 mL 18 mol·L-1H2SO4，定容后放入還原鐵；取5.00 mL上述冷卻溶液于50 mL容量瓶中，再加入蒸餾水配制成800 μmol·L-1FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；繼續(xù)用蒸餾水稀釋，制備25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定593 nm處吸光度，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用FRAP法[13]測(cè)定總抗氧化能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度(A490)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，葡萄糖濃度在0.1～0.5 mg·mL-1范圍內(nèi)與A490呈線性關(guān)系。回歸方程為y=1.059x-0.0167,R2=0.9988。

2.2 多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合多糖提取過(guò)程中各個(gè)單因素的相互關(guān)系，以提取溫度、提取時(shí)間及料液比為考察因素，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

由表2可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響大小為：C>B>A，即影響最大的是料液比，其次是提取時(shí)間，提取溫度影響最小，最優(yōu)提取條件為A1B1C1，即提取溫度75 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶30(g∶mL，下同)，在此條件下，多糖提取率達(dá)到3.14%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

2.3 多糖的抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

處于DPPH自由基中心位置的氮原子上的單電子對(duì)517 nm波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收，使得DPPH自由基醇溶液呈紫色。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，醇溶液褪色的程度與氮原子上單電子接受的電子數(shù)目呈劑量關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]，采用紫外分光光度法測(cè)定了多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著多糖濃度的增大，DPPH自由基清除率逐漸升高。表明，土曲霉GX7-3B多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

2.3.2 總抗氧化能力

人體自由基的量在代謝正常的情況下是處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)外界環(huán)境(如太陽(yáng)光的輻射、吸入污染的氣體、吸煙等)發(fā)生變化時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡極易被破壞，導(dǎo)致自由基積累，傷害人體正常組織，甚至引發(fā)腫瘤、心臟病和老年癡呆等。為了防止和減輕自由基造成的損害，需要合適的自由基清除劑。研究顯示[15-16]，大多數(shù)真菌多糖能通過(guò)增強(qiáng)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性來(lái)清除自由基。為此，本實(shí)驗(yàn)采用FRAP法研究紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的總抗氧化能力，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，多糖總抗氧化能力見(jiàn)圖4。

圖2 多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖3 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 多糖的總抗氧化能力

從圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)多糖濃度每增加一倍，總抗氧化能力會(huì)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；當(dāng)多糖濃度達(dá)到最大，即1 mg·mL-1時(shí)，F(xiàn)RAP值可以達(dá)到103.2，總抗氧化能力最強(qiáng)。表明，紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的總抗氧化能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取條件為：提取溫度75 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此條件下，多糖提取率達(dá)到3.14%。紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖清除DPPH自由基的能力和總抗氧化能力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。表明，紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖是一種較好的天然抗氧化劑，具有開(kāi)發(fā)成為藥物或功能食品的潛力。

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打擊非法集資 共創(chuàng)社會(huì)和諧

——《化學(xué)與生物工程》編輯部

Optimization on Extraction Process of Polysaccharides from Mangrove EndophyticAspergillusterreusGX7-3B and Their Antioxidant Activity

DENG Chun-mei,HE Lan-zhen,ZHANG Guo-guang,LI Si-dong,WEN Yan-mei,WU Yu-lian,HUANG Deng-wei,KANG Xin-huang*

(SchoolofChemistryandEnvironment,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang534088,China)

TheextractionprocessofpolysaccharidesfrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasoptimizedthroughanorthogonalexperiment.ThepolysaccharideswerepurifiedbydeproteinizationusingSevagereagent.Theantioxidantactivityin vitrowasevaluatedbythescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantability.Resultsindicatedthattheoptimumextractionconditionsofpolysaccharideswereasfollows:extractiontemperatureof75 ℃,extractiontimeof3h,solid-liquidratioof1∶30(g∶mL).Theextractionrateofpolysaccharidesreached3.14%underaboveconditions.ThescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantabilityshowedapositiverelationshipwiththeconcentrationofpolysaccharidesinrangeoftestingconcentrations,whichsuggestedthatpolysaccharidefrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasanaturalantioxidant.

mangrove;Aspergillus terreus;polysaccharide;extraction;antioxidantactivity

湛江市科技局自然科學(xué)基金項(xiàng)目(A15445，A14457)，廣東海洋大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(E13503，Q14176)

2016-12-15

鄧春梅(1968-)，女，江西南昌人，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然藥物化學(xué)，E-mail：dcm2382405@163.com；通訊作者：康信煌，副教授，E-mail：kang.xinhuang@gmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.009

O636.1 R931

A

1672-5425(2017)06-0041-04

鄧春梅，何蘭珍，張國(guó)光，等.紅樹(shù)林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：41-44.