柴 丹，王祥珍

(深圳市南山區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000)

不孕癥是婦科常見病之一，多數(shù)病人經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)檢查程序能明確病因，但仍有10%～20%患者至今未能找到確切病因[1]，稱之為不明原因不孕癥。良好的子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入能力是決定胚胎成功著床的兩大關(guān)鍵因素[2]。多種細(xì)胞因子參與子宮內(nèi)膜容受性的建立，細(xì)胞因子表達(dá)異常導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降可能是不明原因不孕癥的病因之一。有研究證實(shí)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptorantagonist,IL-1ra) 共同存在于子宮內(nèi)膜,并通過其在子宮內(nèi)膜周期性表達(dá)調(diào)控生殖[3]。目前關(guān)于IL-1β及IL-1ra在不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜種植窗口期的表達(dá)鮮有報(bào)道。本研究通過檢測(cè)并對(duì)比不明原因不孕患者與正常女性子宮內(nèi)膜種植窗期IL-1β及IL-1ra 信使核苷酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)是否存在表達(dá)差異，為不明原因不孕癥患者的臨床干預(yù)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014-05—2016-10間在南山區(qū)婦幼保健院就診的不明原因不孕患者50例為觀察組，年齡25～35歲，平均年齡(31.27±2.24)歲，月經(jīng)周期26～32 d，平均月經(jīng)周期(28.80±2.04)d。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)知情同意；(2)排除內(nèi)分泌、免疫性因素引起的不孕；(3)排除盆腔及生殖系統(tǒng)器質(zhì)性及感染性病變導(dǎo)致的不孕；(4)半年內(nèi)未用激素類藥物；(5)不孕期限≥1年；(6)丈夫精液檢查:密度≥2000 萬(wàn)/ mL,活動(dòng)力a≥25%或a+ b≥50%,頭部形態(tài)正常精子≥40%。對(duì)照組：選取同期在該院就診曾有過生育史或男方不育后經(jīng)ICSI、AID成功受孕的女性50例為對(duì)照組,年齡23～36歲，平均年齡(30.44±1.78)歲，月經(jīng)周期26～33 d，平均月經(jīng)周期(29.56±1.66)d,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)知情同意；(2)排除內(nèi)分泌、免疫性因素引起的不孕；(3)排除盆腔及生殖系統(tǒng)器質(zhì)性及感染性病變導(dǎo)致的不孕；(4)半年內(nèi)未用激素類藥物。兩組患者在年齡、月經(jīng)周期等一般資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 標(biāo)本收集及保存

取觀察組及對(duì)照組部分子宮內(nèi)膜， 按Noyes 的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]判定為黃體中期子宮內(nèi)膜，在生理鹽水中反復(fù)漂洗干凈，裝入RNA酶滅活的冷凍管，液氮速凍后，置-70℃凍存。

1.3 方法

采用RT-PCR 方法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中IL-1β、IL-1ra的mRNA表達(dá)。

(1)子宮內(nèi)膜組織中RNA的提取。 取研究對(duì)象標(biāo)本約50mg，使用RNAiso Plus(Takara，9109)提取內(nèi)膜組織中total RNA。取其中2 μL用Nanodrop 2000測(cè)濃度，根據(jù)測(cè)得的濃度做逆轉(zhuǎn)錄。剩余total RNA溶液-80 ℃保存。(2)cDNA第一鏈的合成。 cDNA第一鏈的合成按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher，K1622)的說明書進(jìn)行。步驟如下：①在無(wú)菌、無(wú)RNA酶的PCR管中按照下列體系添加試劑：RNA模版4 μg，Random primer 1 μL，Oligo(dT)primer 1 μL，Water，nuclease-free to 12 μL，此步反應(yīng)總體系為12 μL。 ②混勻，置于PCR儀中65℃，5min。③反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管置于冰上，再按5×Reaction Buffer4 μL，RibolockTM RNase Inhibitor 1 μL，10mM dNTP Mix 2 μL，Reverse Transcriptase 1 μL的反應(yīng)體系添加試劑。 ④混勻，置于PCR儀中42 ℃反應(yīng)60min； 70 ℃反應(yīng)5min終止。所得產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中備用。(3)目的基因片段擴(kuò)增。①引物的設(shè)計(jì)與合成。 根據(jù)Genbank中人類IL-1β和IL-1RA的序列，利用primer premier 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)引物，并用NCBI中Primer-BLAST檢測(cè)引物特異性。人IL-1β上游引物：5-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3′，下游引物：5′-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3′，引物總長(zhǎng)391bp；人IL-1RA上游引物：5′-AATCCAGCAAGATGCAAGCC-3′，下游引物5′-ACGCCTTCGTCAGGCATATT-3′，引物總長(zhǎng)406bp；人β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，引物總長(zhǎng)250bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。②PCR反應(yīng)。 PCR反應(yīng)體系：DNA模版0.5 μL，2x Taq MasterMix 12.5 μL，RNase free water 11 μL，上下游引物各1 μL，共25μL；PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min，94℃ 變性30s，58.6℃ 退火20s *31個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸1min， 72℃ 終延伸10min；產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,1600)拍照分析。(4)結(jié)果分析。將β-actin作為定量IL-1β及IL-1ra 的參照物，利用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)出IL-1β，IL-1ra和β-actin 的條帶灰度，分別將IL-1β灰度值、IL-1ra灰度值與β-actin灰度值相除計(jì)算其相對(duì)系數(shù)，從而得出IL-1β和IL-1ra 基因產(chǎn)物的相對(duì)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1β mRNA表達(dá)情況

IL-1β mRNA擴(kuò)增效果見圖1，其中觀察組陽(yáng)性檢出率為86%，對(duì)照組為92%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1；檢出陽(yáng)性標(biāo)本中，觀察組表達(dá)平均值為0.165±0.123，低于對(duì)照組表達(dá)平均值0.331±0.121，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

注：M:標(biāo)記物；1,2,3,4,5為觀察組；1’,2’,3’,4’,5’為對(duì)照組.圖1 子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1β mRNA RT-PCR擴(kuò)增圖

2.2 觀察組與對(duì)照組子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1ra mRNA表達(dá)情況

IL-1ra mRNA擴(kuò)增效果見圖2，其中觀察組陽(yáng)性檢出率為84%，對(duì)照組為82%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1；檢出陽(yáng)性標(biāo)本中，觀察組表達(dá)平均值為0.255±0.094，低于對(duì)照組表達(dá)平均值0.032±0.039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

注：M:標(biāo)記物r；1,2,3,4,5為觀察組；1’,2’,3’,4’,5’為對(duì)照組圖2 子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1ra mRNA RT-PCR擴(kuò)增圖

2.3 觀察組與對(duì)照組子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1ra與IL-1β表達(dá)比情況

IL-1β mRNA及IL-1ra mRNA均陽(yáng)性者，觀察組檢出率陽(yáng)性為84%，對(duì)照組為82%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1；觀察組IL-1ra與IL-1β表達(dá)比(IL-1ra/IL-1β)平均值為9.365±9.623，明顯高于對(duì)照組表達(dá)平均值0.233±0.178，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 觀察組與對(duì)照組子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1β mRNA、IL-1ra mRNA檢出情況

表2 觀察組與對(duì)照組子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1β mRNA、

3 討論

胚胎著床是一個(gè)極其復(fù)雜的程序化過程，良好的子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入能力是決定著床成功與否的關(guān)鍵。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜允許胚胎黏附、侵入并誘導(dǎo)內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生一系列變化，最終使胚胎順利植入的一種狀態(tài)。子宮內(nèi)膜種植窗口期[5]是指子宮內(nèi)膜表現(xiàn)出最大容受性的一段時(shí)期，大約在月經(jīng)周期的第19～24 d,或在LH 峰出現(xiàn)后的7～11 d，一旦超過該期，子宮內(nèi)膜的著床窗閉合，胚胎無(wú)法植入。隨著圍著床期各種調(diào)節(jié)因素的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)種植窗口期的出現(xiàn)和消失依賴于子宮內(nèi)膜中一套特定基因的時(shí)空特異性表達(dá)并與某些黏附分子、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)相關(guān)。生殖系統(tǒng)的細(xì)胞因子主要由圍著床期子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌，通過自分泌、旁分泌方式執(zhí)行多種生理功能，其表達(dá)峰谷值與植入窗口期相吻合，且定位較專一，在子宮內(nèi)膜容受性形成上發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)膜局部細(xì)胞因子表達(dá)失衡導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降可能是導(dǎo)致不明原因不孕癥的病因之一。

IL-1 由3個(gè)相關(guān)多肽組成,其中IL-1α及IL-1β為受體激動(dòng)因子, IL-1rα為受體拮抗因子。三者都主要與受體IL-1I( IL-1Rt I)結(jié)合發(fā)揮作用。IL-1通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的增加,使上皮對(duì)胚泡的黏附性升高,調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性[6]；通過激發(fā)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞整合素avβ3的表達(dá),并通過控制其效應(yīng)分子瘦素( leptin)及其受體的表達(dá)量間斷控制整合素avβ3的表達(dá)量，使子宮內(nèi)膜暴露著床窗，誘導(dǎo)胚泡著床，IL-1 ra 則作用相反，妨礙胚泡與子宮內(nèi)膜的黏附[7]。研究表明, IL-1β在分泌中期形成表達(dá)高峰，IL-1ra 在分泌中期形成表達(dá)低谷，通過兩者的比值調(diào)控IL-1 在生殖活動(dòng)中的作用[8-9]。

關(guān)于IL-1β及IL-1ra在不明原因不孕女性子宮內(nèi)膜種植窗口期的表達(dá)有無(wú)異常，目前鮮有報(bào)道。本研究中,在參與試驗(yàn)的病例子宮內(nèi)膜種植窗期幾乎均存在IL-1β及IL-1ra mRNA表達(dá)，提示二者可能在參與子宮內(nèi)膜容受性建立的方面發(fā)揮重要作用；與正常女性相比,不明原因不孕婦女子宮內(nèi)膜種植窗口期IL-1β表達(dá)下降，而IL-1ra mRNA表達(dá)則明顯上升，提示二者表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致不明原因不孕癥的主要分子機(jī)制之一；研究顯示[9]，成功的著床依賴于IL-1B/ IL-1 ra 在著床部位有適當(dāng)比例，而本試驗(yàn)中，不明原因不孕患者IL-1ra與IL-1β表達(dá)比平均值為(9.365±9.623)，明顯高于對(duì)照組表達(dá)比平均值(0.233±0.178)，提示IL-1β及IL-1ra mRNA表達(dá)比例失調(diào)可能是妨礙上皮對(duì)胚泡的黏附的重要原因之一，這對(duì)于臨床上通過檢測(cè)IL-1β及IL-1ra的表達(dá)來(lái)診斷以及治療不明原因不孕提供了新思路。

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