李美荃 張春勇 計喬平 陳克嶙 郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點試驗室，昆明650021)

血紅素鐵對妊娠母鼠繁殖成績及組織鐵調(diào)基因表達(dá)的影響

李美荃 張春勇 計喬平 陳克嶙 郭榮富*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點試驗室，昆明650021)

本試驗旨在探索血紅素鐵與硫酸亞鐵(FeSO4)對妊娠母鼠繁殖成績，妊娠母鼠組織與胎鼠鐵含量，妊娠母鼠組織鐵調(diào)素(hepcidin)、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)、貓白血病病毒C亞類受體(Flvcr)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Tfr1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(Tfr2)、二價金屬轉(zhuǎn)運體1(DMT1)和血紅素轉(zhuǎn)運蛋白(HCP)表達(dá)的影響。隨機(jī)選取2月齡體況接近的昆明小鼠母鼠80只，隨機(jī)分為8組，分別為對照組、缺鐵組、血紅素鐵組(15、60、90 mg/kg血紅素鐵)、FeSO4組(75、300、450 mg/kg FeSO4)，每組10只。配種受孕起對照組飼喂正常飼糧(基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg FeSO4)；其他各組均飼喂基礎(chǔ)飼糧，妊娠第10～13天注射40 mg/kg去鐵胺(DFO)，誘導(dǎo)妊娠母鼠缺鐵模型；妊娠第14天血紅素鐵組和FeSO4組開始在基礎(chǔ)飼糧中添加血紅素鐵或FeSO4，缺鐵組不添加。試驗期為妊娠后1～20 d。結(jié)果表明：1)60 mg/kg血紅素鐵組胎鼠重最高，極顯著高于對照組與缺鐵組(P<0.01)。2)60 mg/kg血紅素鐵組與450 mg/kg FeSO4組母鼠血液血紅蛋白(HGB)含量、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和紅細(xì)胞容積(HCT)極顯著高于缺鐵組(P<0.01)。3)60 mg/kg血紅素鐵組胎鼠鐵含量最高，極顯著高于對照組與FeSO4組(P<0.01)；450 mg/kg FeSO4組母鼠肝臟、脾臟和胎盤鐵含量均為最高。4)90 mg/kg血紅素鐵組和450 mg/kg FeSO4組母鼠肝臟hepcidin表達(dá)量較高，極顯著高于缺鐵組與對照組(P<0.01)；15 mg/kg血紅素鐵組母鼠肝臟Fpn、Tfr2表達(dá)量較高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)；60 mg/kg血紅素鐵組母鼠肝臟Tfr1、Flvcr表達(dá)量較高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)；75 mg/kg FeSO4組母鼠肝臟Tfr1表達(dá)量較高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。5)缺鐵組母鼠十二指腸Fpn、HCP、DMT1、Flvcr表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.01)。6)缺鐵組母鼠胎盤Fpn、Tfr1、DMT1、Flvcr、HCP表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)；90 mg/kg血紅素鐵組和450 mg/kg FeSO4組母鼠胎盤hepcidin表達(dá)量較高，極顯著高于缺鐵組與對照組(P<0.01)。7)飼糧血紅素鐵添加量為61.00 mg/kg或FeSO4添加量為336.11 mg/kg時，胎鼠鐵含量最高；飼糧血紅素鐵添加量為93.49 mg/kg時，母鼠肝臟鐵含量最高。綜合得出，母鼠飼糧中添加適宜量的血紅素鐵或FeSO4均可顯著促進(jìn)胎鼠增重，誘導(dǎo)母鼠靶組織鐵調(diào)基因的表達(dá)，提高母鼠組織和妊娠20 d胎鼠機(jī)體鐵含量；HCP和Flvcr在母鼠腸道對血紅素鐵吸收或胎盤轉(zhuǎn)運起至關(guān)重要的作用，但腸道吸收或胎盤轉(zhuǎn)運FeSO4主要以DMT1和Tfr2為主。

妊娠母鼠；血紅蛋白；鐵含量；鐵調(diào)素；血紅素鐵

鐵是動物必需的微量元素之一，缺鐵或鐵過量均影響仔豬健康和制約仔豬遺傳潛力的充分發(fā)揮。目前，缺鐵性貧血是新生仔豬面臨的普遍問題。從妊娠母豬尋找新型、安全高效的有效鐵源已成為改善母豬繁殖性能和促進(jìn)新生仔豬生長發(fā)育的重要研究課題。白松濤[1]、趙惠君[2]研究報道，妊娠后期及哺乳期缺鐵會嚴(yán)重導(dǎo)致嬰幼兒生長不良。母體攝入的血紅素鐵與非血紅素鐵會影響新生兒肝臟儲鐵的含量。血紅素鐵是與血紅蛋白(HGB)及肌紅蛋白、腦紅蛋白中的卟啉結(jié)合的鐵，它以卟啉鐵的形式直接被腸黏膜上皮細(xì)胞吸收。Cao等[3]采用同位素跟蹤法證明鐵的狀態(tài)(血紅素鐵或非血紅素鐵)影響胎盤鐵的轉(zhuǎn)移，母體血清鐵調(diào)素(hepcidin)含量及母體、初生兒鐵的狀態(tài)與母體攝入的血紅素與非血紅素鐵密切相關(guān)，妊娠末期，母體攝入血紅素鐵可能更優(yōu)先轉(zhuǎn)移入胎兒。Furuyama等[4]研究報道，血紅素在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路和基因表達(dá)方面起重要作用。近十年研究顯示，hepcidin在機(jī)體維持鐵穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，其通過調(diào)節(jié)膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(Fpn1)、二價金屬轉(zhuǎn)運體1(DMT1)、腸細(xì)胞色素b(Dcytb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Tfr1)，協(xié)調(diào)和控制鐵離子在細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境之間的轉(zhuǎn)運[5-6]。hepcidin可以直接與膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)作用，使其內(nèi)化和降解，控制鐵的輸出[7]?，F(xiàn)行仔豬的補(bǔ)鐵方式尚需要進(jìn)一步完善。迄今，血紅素鐵對新生仔豬補(bǔ)鐵效應(yīng)的研究鮮見報道。本試驗以妊娠母鼠構(gòu)建缺鐵模型，研究血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠繁殖成績，妊娠母鼠組織與胎鼠鐵含量，妊娠母鼠組織hepcidin、Fpn、貓白血病病毒C亞類受體(Flvcr)、Tfr1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(Tfr2)、DMT1和血紅素轉(zhuǎn)運蛋白(HCP)表達(dá)的影響，為探索新生仔豬有效補(bǔ)鐵途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

血紅素鐵(由云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室單胃動物營養(yǎng)研究室提供，從豬血液中提取，純度為98%，血紅素含量為20%，鐵含量為2%，剩余成分為HGB、肽、氨基酸等)；FeSO4、去鐵胺(DFO)均為試劑級，購自美國Sigma公司。

1.2 試驗設(shè)計

隨機(jī)選取來源一致、健康、飼養(yǎng)方式相同和體重相近的2月齡昆明小鼠母鼠80只，單籠飼養(yǎng)，母鼠平均體重為32.15 g。每籠放入1只公鼠配種，母鼠受孕后，移除公鼠。妊娠母鼠隨機(jī)分為8組，分別為對照組、缺鐵組、血紅素鐵組(15、60、90 mg/kg血紅素鐵)、FeSO4組(75、300、450 mg/kg FeSO4)，每組10只。配種受孕起開始飼喂，缺鐵組、血紅素鐵組、FeSO4組母鼠均飼喂基礎(chǔ)飼糧，妊娠期母鼠第10～13天注射40 mg/kg DFO，誘導(dǎo)缺鐵模型，第14天血紅素鐵組和FeSO4組開始在基礎(chǔ)飼糧中添加血紅素鐵或FeSO4，缺鐵組不添加；對照組母鼠飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg FeSO4的正常飼糧[根據(jù)NRC(1995)標(biāo)準(zhǔn)]。試驗期為妊娠后1～20 d。

1.3 飼糧配制與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。在清潔動物房內(nèi)，試驗鼠單籠飼養(yǎng)于專用鼠代謝籠，環(huán)境溫度在(24±1) ℃，相對濕度在40%～60%。自由飲食及飲水，自然晝夜節(jié)律變化光照。

1.4 樣品采集

第20天07:30空腹稱重后，前腔靜脈采血3 mL，隨后屠宰。采集母鼠胎盤、肝臟、脾臟、十二指腸及胎鼠，稱重后迅速剪碎，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血液指標(biāo)測定

母鼠血液HGB含量、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和紅細(xì)胞容積(HCT)采用邁瑞B(yǎng)C-2800全自動血液細(xì)胞分析儀測定。

1.6 原子吸收法測定鐵含量

準(zhǔn)確稱取100 mg待測組織樣品置于去鐵處理后的消化管中，加入工作液1 mL(高氯酸∶濃硝酸=1∶4)，放入消化器孔內(nèi)。首先在70 ℃消化3～4 h，然后依次升溫到100、120、150、180、200 ℃，直至消化到溶液透明澄清為止。消化完畢溶液晾涼后轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用去離子水清洗消化管，移入定容瓶直至用去離子水定容到10 mL刻度待測。

1.7 鐵調(diào)基因表達(dá)量測定

1.7.1 總RNA提取

各組織總RNA提取按照RNAsimple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司試劑]說明書進(jìn)行，每50～100 mg組織加1 mL裂解液，經(jīng)過研磨粉碎勻漿后，加入氯仿萃取。最后得到的總RNA溶解于超純水中，總RNA的純度與濃度分別用分光光度計在260與280 nm下檢測吸光度(OD)值，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0方可采用。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kilogram of the diet：CuSO424.01 mg, MnSO481.89 mg,ZnSO468.83 mg,Na2SeO30.33 mg,KI 0.27 mg,MgO 927.64 mg,VA 2 400 IU,VD 1 000 IU,VE 32 IU,VB15 mg,VB27 mg，泛酸 pantothenic acid 16 mg，煙酸 nicotinic acid 15 mg，膽堿 choline 2 000 mg，葉酸0.5 mg。

2)消化能為計算值，其他為實測值。DE was a calculated value, while the others were measured values.

1.7.2 反轉(zhuǎn)錄

總RNA樣品按試劑盒(TaKaRa,日本)說明書要求配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總體系10 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)于-20 ℃保存。

1.7.3 實時熒光定量PCR

cDNA用于實時熒光定量PCR。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，各基因引物序列見表2。引物采用Primer Express軟件設(shè)計。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有組織的鐵調(diào)節(jié)基因均是以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量，表達(dá)量參考Pfaffl[8]的方法計算。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著的采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠繁殖性能的影響

由表3可見，60 mg/kg血紅素鐵組、300 mg/kg FeSO4組母鼠增重最多，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。60 mg/kg血紅素鐵組胎鼠重和母鼠肝臟重最高，其中胎鼠重極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。

2.2 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠血液HGB含量、RBC和HCT的影響

由表4可見，60 mg/kg血紅素鐵組與450 mg/kg FeSO4組母鼠血液HGB含量、RBC和HCT極顯著高于缺鐵組(P<0.01)。

2.3 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠組織與胎鼠鐵含量的影響

由表5可見，90 mg/kg血紅素鐵組、450 mg/kg FeSO4組母鼠肝臟鐵含量較高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。450 mg/kg FeSO4組母鼠脾臟鐵含量最高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。300 mg/kg FeSO4組和450 mg/kg FeSO4組母鼠胎盤鐵含量極顯著高于血紅素鐵組(P<0.01)。缺鐵組母鼠肝臟、脾臟、胎盤和胎鼠鐵含量均極顯著低于對照組(P<0.01)。

母鼠肝臟和胎鼠鐵含量與飼糧血紅素鐵添加量呈二次曲線變化(P<0.01)。由二次曲線求值得出，飼糧血紅素鐵添加量為93.49 mg/kg時，母鼠肝臟鐵含量最高(圖1-A、圖1-B)；飼糧血紅素鐵添加量為61.00 mg/kg時，胎鼠鐵含量最高(圖1-C、圖1-D);飼糧FeSO4添加量為336.11 mg/kg時，胎鼠鐵含量最高(圖1-E)；飼糧FeSO4添加量為511.85 mg/kg時，母鼠肝臟鐵含量最高(圖1-F)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

表3 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠繁殖性能的影響Table 3 Effects of heme Fe and FeSO4 on breeding performance of pregnant mouse

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表4 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠血液HGB含量、RBC和HCT的影響Table 4 Effects of heme Fe and FeSO4 on blood HGB content， RBC and HCT of pregnant mouse

表5 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠組織與胎鼠鐵含量的影響Table 5 Effects of heme Fe and FeSO4 on iron content in tissues of pregnant mice and their foetuses mg/kg

2.4 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響

由圖2-A可知，缺鐵組母鼠肝臟hepcidin表達(dá)量極顯著低于對照組(P<0.01)；隨著血紅素鐵添加量的增加，肝臟hepcidin表達(dá)量上升；90 mg/kg血紅素鐵組肝臟hepcidin表達(dá)量較高，與對照組差異極顯著(P<0.01)。由圖2-B可知，母鼠肝臟Fpn表達(dá)量隨著血紅素鐵添加量的增加而降低，15 mg/kg血紅素鐵組肝臟Fpn表達(dá)量較高，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖2-C可知，60 mg/kg血紅素鐵組母鼠肝臟Tfr1表達(dá)量較高，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖2-D可知，缺鐵組母鼠肝臟Tfr2表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)；Tfr2表達(dá)量隨著血紅素鐵添加量的增加而降低，15 mg/kg血紅素鐵組較高，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖2-E可知，60 mg/kg血紅素鐵組母鼠肝臟Flvcr表達(dá)量較高，極顯著高于對照組和缺鐵組(P<0.01)。

由圖3-A可知，隨著FeSO4添加量的增加，母鼠肝臟hepcidin表達(dá)量上升；450 mg/kg FeSO4組肝臟hepcidin的表達(dá)量較高，與對照組差異極顯著(P<0.01)。由圖3-B可知，母鼠肝臟Fpn表達(dá)量隨著FeSO4添加量的增加而降低，75 mg/kg FeSO4組肝臟Fpn表達(dá)量較高，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖3-C可知，75 mg/kg FeSO4組母鼠肝臟Tfr1表達(dá)量較高，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖3-D可知，母鼠肝臟Tfr2表達(dá)量隨著FeSO4添加量的增加而降低，75 mg/kg FeSO4組極顯著高于對照組(P<0.01)。由圖3-E可知，F(xiàn)eSO4組母鼠肝臟Flvcr表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.5 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠十二指腸鐵調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響

由圖4-A可知，缺鐵組母鼠十二指腸Fpn表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)；Fpn表達(dá)量血紅素鐵添加量的增加而降低，90 mg/kg血紅素鐵組Fpn表達(dá)量較低，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖4-B可知，缺鐵組和15 mg/kg血紅素鐵組母鼠十二指腸HCP表達(dá)量較高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；隨血紅素鐵添加量的增加，HCP表達(dá)量下降。由圖4-C、圖4-D可知，缺鐵組母鼠十二指腸DMT1、Flvcr

表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)，隨血紅素鐵添加量的增加，DMT1、Flvcr表達(dá)量下降。

Con：對照組 control group;DEF:缺鐵組 Fe deficiency group。下圖同。 The same as below.

**表示差異極顯著(P<0.01)。** mean extremely significant difference (P<0.01).

圖1 飼糧血紅素鐵添加量與妊娠母鼠肝臟和胎鼠鐵含量的二次曲線變化

Fig.1 Quadratic curve changes of dietary heme Fe supplemental level and iron content of pregnant mice liver and fetuses

由圖5-A可知，75 mg/kg FeSO4組母鼠十二指腸Fpn表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)；Fpn表達(dá)量隨著FeSO4添加量的增加而降低，450 mg/kg FeSO4組較低，與對照組和缺鐵組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖5-B可知，各FeSO4組母鼠十二指腸HCP表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.01)，與缺鐵組差異不顯著(P>0.05)。由圖5-C、圖5-D可知，隨FeSO4添加量的增加，母鼠十二指腸DMT1、Flvcr表達(dá)量下降，但均極顯著高于對照組(P<0.01)，且極顯著低于缺鐵組(P<0.01)。

2.6 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠胎盤鐵調(diào)基因表達(dá)的影響

由圖6-A可知，缺鐵組母鼠胎盤hepcidin表

達(dá)量低于對照組，差異極顯著(P<0.01)。隨著血紅素鐵添加量的增加，hepcidin表達(dá)量上升；血紅素鐵組中，90 mg/kg血紅素鐵組hepcidin的表達(dá)量較高，與對照組差異極顯著(P<0.01)。由圖6-B可知，缺鐵組和15 mg/kg血紅素鐵組母鼠胎盤Fpn表達(dá)量較高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；Fpn表達(dá)量隨著血紅素鐵添加量的增加而降低。由圖6-C、圖6-D、圖6-E可知，缺鐵組母鼠胎盤Tfr1、DMT1、Flvcr表達(dá)量較高，與其他組相比差異極顯著(P<0.01)。由圖6-F可知，缺鐵組和15 mg/kg血紅素鐵組母鼠胎盤HCP表達(dá)量極顯著高于其他組(P<0.01) 。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

圖2 血紅素鐵對妊娠母鼠肝臟hepcidin(A)、Fpn(B)、Tfr1(C)、Tfr2(D)、Flvcr(E)表達(dá)的影響

Fig.2 Effects of heme Fe on expressions of hepcidin (A)，F(xiàn)pn(B)，Tfr1 (C)，Tfr2 (D) andFlvcr(E) in liver of pregnant mice

由圖7-A可知，隨著FeSO4添加量的增加，母鼠胎盤hepcidin表達(dá)量上升；FeSO4組中，450 mg/kg FeSO4組hepcidin的表達(dá)量較高，與對照組差異極顯著(P<0.01)。由圖7-B可知，75 mg/kg FeSO4組母鼠胎盤Fpn表達(dá)量較高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；Fpn表達(dá)量隨著FeSO4添加量的增加而降低。由圖7-C、圖7-D、圖7-E、圖7-F可知，缺鐵組母鼠胎盤Tfr1、DMT1、Flvcr、HCP表達(dá)量較高，與其他組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 適宜添加量的血紅素鐵和FeSO4改善妊娠母鼠的繁殖成績

微量元素鐵對胎兒生長發(fā)育具有重要影響。抗貧血膠囊改善大鼠缺鐵性貧血的研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充血紅素鐵可顯著增加大鼠體重，增加血清鐵含量。解超等[9]研究報道，鵝血紅素顯著增加患缺鐵性貧血癥幼齡大鼠體重和體長，促進(jìn)其生長發(fā)育。本試驗結(jié)果表明，飼喂血紅素鐵和FeSO4可以提高母鼠生產(chǎn)性能，母鼠飼喂血紅素鐵更能提高胎兒體重。鐵過載時注射DFO，可降低機(jī)體鐵含量。缺鐵情況下，補(bǔ)加血紅素鐵有提高胎鼠個數(shù)的趨勢。

圖3 FeSO4對妊娠母鼠肝臟hepcidin(A)、Fpn(B)、Tfr1(C)、Tfr2(D)、Flvcr(E)表達(dá)的影響Fig.3 Effects of FeSO4 on expressions of hepcidin (A)， Fpn (B)， Tfr1 (C)， Tfr2 (D) andFlvcr (E) in liver of pregnant mice

圖4 血紅素鐵對妊娠母鼠十二指腸Fpn(A)、HCP(B)、DMT1(C)、Flvcr(D)表達(dá)的影響Fig.4 Effects of heme Fe on expressions of Fpn (A)， HCP (B)， DMT1 (C) and Flvcr (D) in duodenum of pregnant mice

圖5 FeSO4對妊娠母鼠十二指腸Fpn(A)、HCP(B)、DMT1(C)、Flvcr(D)表達(dá)的影響Fig.5 Effects of FeSO4 on expressions of Fpn (A)， HCP (B)， DMT1 (C) and Flvcr (D) in duodenum of pregnant mice

圖6 血紅素鐵對妊娠母鼠胎盤hepcidin(A)、Fpn(B)、Tfr1(C)、DMT1(D)、Flvcr(E)、HCP(F)表達(dá)的影響Fig.6 Effects of heme Fe on expressions of hepcidin (A)， Fpn (B)， Tfr1 (C)， DMT1 (D)， Flvcr (E) andHCP (F)in placenta of pregnant mice

圖7 FeSO4對妊娠母鼠胎盤hepcidin(A)、Fpn(B)、Tfr1(C)、DMT1(D)、Flvcr(E)、HCP(F)表達(dá)的影響Fig.7 Effects of FeSO4 on expressions of hepcidin (A)， Fpn (B)， Tfr1 (C)， DMT1 (D)，F(xiàn)lvcr (E) and HCP (F)in placenta of pregnant mice

3.2 適宜添加量的血紅素鐵和FeSO4提高妊娠母鼠血液HGB含量和RBC

HGB是標(biāo)識動物機(jī)體鐵含量的重要指標(biāo)。游開紹等[10]對氯高鐵血紅素和富馬酸亞鐵治療小兒缺鐵性貧血的療效進(jìn)行了比較，結(jié)果表明氯高鐵血紅素口服液治療后，血液HGB含量顯著高于對照組，血液中紅細(xì)胞游離原卟啉、血紅蛋白中紅細(xì)胞游離原卟啉含量低于對照組，說明氯高鐵血紅素治療小兒缺鐵性貧血的效果優(yōu)于富馬酸亞鐵。鐘才云等[11]用大鼠HGB恢復(fù)性試驗研究血紅素鐵的抗貧血作用與生物利用率，證明血紅素鐵具有良好的抗貧血效果，與本試驗結(jié)果一致。本試驗結(jié)果表明，飼喂母鼠60 mg/kg血紅素鐵時與450 mg/kg FeSO4時其血液HGB含量、RBC極顯著高于缺鐵組。飼糧添加鐵源能夠提高母鼠血液中HGB含量。

3.3 適宜添加量的血紅素鐵和FeSO4增加妊娠母鼠組織及胎鼠鐵含量

動物機(jī)體肝臟，脾臟是儲鐵的重要器官，反映機(jī)體鐵營養(yǎng)的重要參數(shù)。胎鼠個體鐵含量直接反應(yīng)由母鼠轉(zhuǎn)運至胎兒的鐵量。De Carli等[12]研究報道，短期膳食鎂的限制，可以降低由于長期飼喂高脂肪飲食造成的生長期大鼠脾臟鐵含量。本試驗結(jié)果表明，缺鐵情況下，DFO耗竭，極顯著降低胎鼠鐵含量。母鼠飼喂90 mg/kg血紅素鐵、450 mg/kg FeSO4母鼠肝臟鐵含量較高，母鼠飼喂FeSO4胎盤內(nèi)鐵含量顯著高于飼喂血紅素鐵。血紅素鐵可顯著增加胎鼠個體鐵含量。

3.4 血紅素鐵和FeSO4對妊娠母鼠肝臟、十二指腸、胎盤鐵調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響

hepcidin是介導(dǎo)鐵調(diào)節(jié)的重要因子，本試驗以hepcidin為中心，對母鼠肝臟、十二指腸、胎盤組織的鐵儲存、吸收、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因Fpn、Tfr1、Tfr2、Flvcr、DMT1、HCP進(jìn)行表達(dá)量的檢測。

3.4.1 妊娠母鼠肝臟

hepcidin是重要的鐵調(diào)節(jié)器。Pigeon等[13]、Bolondi等[14]研究報道，小鼠或人類肝臟鐵過載，會增加hepcidin的表達(dá)量。本試驗中，缺鐵組母鼠肝臟hepcidin表達(dá)量低于對照組；隨著血紅素鐵和FeSO4添加量的增加，hepcidin表達(dá)量上升。

Bolondi等[14]和Donovan等[15]研究報道，在Fpn和血漿銅藍(lán)蛋白作用下,亞鐵離子(Fe2+)被轉(zhuǎn)運至血液中完成再循環(huán)的過程，F(xiàn)pn起到了“出口”的作用。Boumaiza等[16]研究報道，生產(chǎn)功能性hepcidin可以在大腸桿菌中實現(xiàn)，經(jīng)純化后，能促使鐵輸出蛋白Fpn降解。本試驗中，F(xiàn)pn表達(dá)量隨著血紅素鐵、FeSO4添加量的增加，F(xiàn)pn表達(dá)量下降；hepcidin與Fpn表達(dá)量趨勢相反。

Tfr是鐵轉(zhuǎn)運的重要蛋白。本試驗中，母鼠飼喂60 mg/kg血紅素鐵和75 mg/kg FeSO4時肝臟Tfr1表達(dá)量較高，隨后降低；Tfr2表達(dá)量隨著血紅素鐵和FeSO4添加量的增加，Tfr2表達(dá)量降低。當(dāng)機(jī)體缺鐵時，Tfr表達(dá)量會升高，促進(jìn)機(jī)體對鐵的吸收，當(dāng)機(jī)體鐵過載時，其表達(dá)量會降低，控制機(jī)體對鐵的輸入。

Flvcr是血紅素鐵輸出轉(zhuǎn)運的主效蛋白。Vinchi等[17]通過小鼠肝臟試驗證實，F(xiàn)lvcr做為血紅素的輸出者，調(diào)控血紅素的合成，且能夠降解和控制細(xì)胞色素P450。本試驗中，飼喂60 mg/kg血紅素鐵時，母鼠肝臟Flvcr表達(dá)量較高，隨后降低；母鼠飼喂不同添加量的FeSO4時，肝臟Flvcr表達(dá)量差異不顯著，推測由于FeSO4屬于無機(jī)鐵，F(xiàn)lvcr主要輸出有機(jī)鐵。

3.4.2 妊娠母鼠十二指腸

血紅素鐵是很好的生物強(qiáng)鐵化劑，可以直接被腸黏膜吸收。Wyllie等[18]給正?；蜩F缺乏大鼠飼喂氯化血紅素鐵，證實血紅素是被小腸黏膜細(xì)胞吸收。鐵的狀態(tài)調(diào)控Fpn的含量，F(xiàn)pn是哺乳動物唯一Fe2+輸出口，F(xiàn)pn突變會導(dǎo)致鐵過載疾病[19]。本試驗結(jié)果表明，隨鐵含量的增加，F(xiàn)pn表達(dá)量下調(diào)，F(xiàn)pn表達(dá)量受機(jī)體內(nèi)鐵狀態(tài)調(diào)控。

HCP是近年來發(fā)現(xiàn)的哺乳動物血紅素細(xì)胞輸入蛋白，是游離血紅素進(jìn)入細(xì)胞的途徑。Shayeghi等[20]研究報道，證實了十二指腸上皮細(xì)胞HCP具有直接攝取血紅素，并將其轉(zhuǎn)運入細(xì)胞內(nèi)的功能，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鐵池被重新利用，高表達(dá)的HCP1，可使血紅素鐵的吸收增加2～3倍。本試驗結(jié)果表明，缺鐵組和飼喂15 mg/kg血紅素鐵時十二指腸HCP表達(dá)量較高，HCP與血紅素鐵的吸收密切相關(guān)，母鼠飼喂不同劑量無機(jī)鐵源，十二指腸HCP表達(dá)量差異不顯著。推測HCP僅與有機(jī)鐵的吸收相關(guān)。

Leong等[21]研究報道，10日齡缺鐵小鼠，機(jī)體內(nèi)缺乏鐵調(diào)節(jié)的吸收機(jī)制，小腸上皮細(xì)胞DMT1和Fpn變化不顯著，20日齡缺鐵小鼠，機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量會顯著上升,補(bǔ)鐵后會顯著下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)。本試驗?zāi)甘髮儆诔赡晔螅瑱C(jī)體內(nèi)有完整的鐵吸收轉(zhuǎn)運機(jī)制，所以鐵缺乏時，DMT1表達(dá)量顯著上升。

Flvcr做為血紅素的輸出者，主要調(diào)控血紅素的合成，與母鼠飼喂無機(jī)鐵關(guān)系不密切。本試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)lvcr主要受有機(jī)鐵調(diào)控。

3.4.3 妊娠母鼠胎盤

Garcia-Valdes等[22]研究報道，肥胖孕婦缺鐵性風(fēng)險更大，主要由于hepcidin的調(diào)控，胎盤會通過增加Tfr1降低產(chǎn)婦缺鐵狀態(tài)。本試驗結(jié)果表明，隨著血紅素鐵和FeSO4添加量的增加，胎盤hepcidin表達(dá)量上升。hepcidin與胎盤鐵的輸出密切相關(guān)。

Bastin等[23]研究發(fā)現(xiàn)Fpn1在胎盤主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的基底膜，其基底面面向胎盤的胎兒面，與鐵從母體向胎兒單向傳遞一致，并且在妊娠的后3個月最高，此時期也是胎兒需要鐵較多的時期，這表明Fpn1在鐵從母體到發(fā)育的胎兒的轉(zhuǎn)運中有著重要作用。李四保等[24]研究報道，不同缺鐵程度孕婦相應(yīng)新生兒鐵狀態(tài)無顯著差異，隨著母體缺鐵程度的加重，血清hepcidin含量下調(diào)，胎盤Fpn表達(dá)量上調(diào)。本試驗結(jié)果顯示缺鐵組和15 mg/kg血紅素鐵或75 mg/kg FeSO4時，母鼠胎盤Fpn表達(dá)量較高。Fpn表達(dá)量隨著鐵含量的增加，F(xiàn)pn表達(dá)量降低。

本試驗中，缺鐵組母鼠胎盤Tfr1、DMT1表達(dá)量較高。結(jié)果提示，當(dāng)機(jī)體內(nèi)鐵含量低時，通過增加Tfr1、DMT1表達(dá)量增加鐵的轉(zhuǎn)運。

Byon等[25]研究報道，F(xiàn)lvcr與紅細(xì)胞形成緊密相關(guān)，可能有助于血小板的成熟，但對正常造血干細(xì)胞的功能是可有可無的。本試驗中，缺鐵組母鼠胎盤Flvcr表達(dá)量較高。

HCP與血紅素鐵吸收轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。有研究報道高表達(dá)量的HCP1可使血紅素鐵的吸收增加2～3倍。本試驗研究報道，母鼠飼喂血紅素鐵，胎鼠機(jī)體鐵含量高于飼喂FeSO4。推測與鐵在胎盤吸收轉(zhuǎn)運機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，母鼠飼喂適宜血紅素鐵可顯著促進(jìn)胎鼠生長發(fā)育和增加胎鼠機(jī)體鐵含量，增加母鼠血液HGB含量；血紅素鐵可通過調(diào)節(jié)腸道鐵吸收，胎盤鐵轉(zhuǎn)運，從而促進(jìn)鐵從母鼠運輸至胎鼠，HCP和Flvcr在腸道對血紅素鐵吸收或胎盤轉(zhuǎn)運起至關(guān)重要的作用。但腸道吸收或胎盤轉(zhuǎn)運FeSO4主要以DMT1或Tfr2為主。二者在吸收轉(zhuǎn)運方面有很大差異；母鼠肝臟和胎鼠與飼糧血紅素鐵添加量呈二次曲線變化，母鼠肝臟鐵含量最高時，其血紅素鐵飼糧適宜添加量為93.49 mg/kg。母鼠飼糧血紅素鐵添加量為61.00 mg/kg，胎鼠機(jī)體鐵含量最高。

4 結(jié) 論

① 血紅素鐵可改善胎鼠生長發(fā)育和提高胎鼠機(jī)體鐵含量；飼糧血紅素鐵適宜添加量為61.00 mg/kg，此添加量下胎鼠鐵含量最高。

② 血紅素鐵和FeSO4均可增加母鼠RBC、HGB含量。飼糧血紅素鐵適宜添加量為93.49 mg/kg，此添加量下母鼠肝臟鐵含量最高。

③ 血紅素鐵和FeSO4可調(diào)節(jié)母鼠靶組織鐵代謝基因的表達(dá)，從而提高組織鐵含量，血紅素鐵誘導(dǎo)母鼠胎盤HCP、Flvcr表達(dá)量上調(diào)，有利于血紅素鐵通過胎盤進(jìn)入胎兒。HCP和Flvcr在母鼠腸道對血紅素鐵吸收和胎盤轉(zhuǎn)運起至關(guān)重要的作用，腸道吸收或胎盤轉(zhuǎn)運FeSO4主要以DMT1和Tfr2為主，二者在吸收轉(zhuǎn)運方面有很大差異，需進(jìn)一步研究。

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*Corresponding author, professor, E-mail： rongfug@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Heme Iron on Reproductive Performance and Iron-Regulated Gene Expressions in Tissues of Pregnant Mice

LI Meiquan ZHANG Chunyong JI Qiaoqing CHEN Kelin GUO Rongfu*

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedScienceofYunnanProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650021，China)

This study was conducted to compare the effects of heme iron (Fe) and ferrous sulfate (FeSO4) on reproductive performance, the Fe content in pregnant mice tissues and fetal mice, and the expressions of Fe-regulated genes [hepcidin, ferroportin (Fpn), feline leukemia virus subgroup C receptor (Flvcr), heme carrier protein (HCP), transferrin receptor 1 (Tfr1), transferrin receptor 2 (Tfr2) and divalent metal transporter 1 (DMT1)] in tissues of pregnant mice. EightyKunmingfemale mice with similar body condition at 2 months of age were selected and randomly divided into 8 groups with 10 mice per group. The groups were control group, Fe deficiency group, heme Fe (15， 60 and 90 mg/kg) groups and FeSO4(75, 300 and 450 mg/kg) groups. Since pregnant, control group was fed normal diet (a basal diet supplemented with 400 mg/kg FeSO4); the other groups were fed the basal diet, and were injected 40 mg/kg deferoxamine to induce Fe deficiency model at 10 to 13 d of pregnant; heme Fe and FeSO4were supplemented in heme Fe groups and FeSO4groups from 14 d of pregnant, while none of them was supplemented in Fe deficiency group. The experiment was carried out at 1 to 20 d of pregnant. The results showed as follows: 1) the weight of fetal mice in 60 mg/kg group was significantly higher than that in control group and Fe deficiency group (P<0.01). 2) Blood hemoglobin (HGB) content, red blood cell (RBC) and hematocrit (HCT) in 60 mg/kg heme Fe group and 450 mg/kg FeSO4group were significantly higher than those in Fe deficiency group (P<0.01). 3) The Fe content in the fetal mice in 60 mg/kg heme Fe group was significantly higher than that in control group and FeSO4groups (P<0.01); the Fe content in liver， spleen and placenta was the highest in450 mg/kg FeSO4group. 4) The expression of hepcidin in liver of pregnant mice was higher in 90 mg/kg heme Fe group and 450 mg/kg FeSO4group， which was significantly higher than that in Fe deficiency group and control group (P<0.01); the expressions ofFpnandTfr2 in liver in 15 mg/kg heme Fe group were higher, which were significantly higher than those in Fe deficiency group and control group (P<0.01); the expressions ofTfr1 andFlvcrin liver in 60 mg/kg heme Fe group were higher， which were significantly higher than those in Fe deficiency group and control group (P<0.01); the expression ofTfr1 in liver in 75 mg/kg FeSO4group was higher, which was significantly higher than that in Fe deficiency group and control group (P<0.01). 5)Fpn,HCP,DMT1 andFlvcrexpressions in duodenum of pregnant mice in Fe deficiency group were significantly higher than those in control group (P<0.01). 6) PlacentaFpn,HCP,DMT1,FlvcrandTfr1 expressions were significantly higher than those in control group (P<0.01); the expression of hepcidin in placenta in 90 mg/kg heme Fe and 450 mg/kg FeSO4was higher, which was significantly higher than that in Fe deficiency group and control group (P<0.01). 7) The Fe content of fetal mice was the highest when heme Fe was 61.00 mg/kg or FeSO4was 336.11 mg/kg; the Fe content in liver of pregnant mice was the highest when heme Fe was 93.49 mg/kg. In conclusion, the supplementation of heme Fe and FeSO4at proper levels can increase the weight of fetal mice, regulate the expressions of Fe-regulating genes in target tissues of pregnant mice, and increase the body Fe content of pregnancy mice and 20 d fetal mice;HCPandFlvcrplay critical roles in the intestinal absorption or placental transport of heme Fe, while intestinal absorption and placental transport of FeSO4mainly rely onDMT1 andTfr2.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：1996-2009]

pregnant mice; hemoglobin; iron content; hepcidin; heme iron

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.06.021

2016-12-01

云南省重大科技計劃——生物育種(2012ZA018-3)

李美荃(1986—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail： limeiquan2010@163.com

*通信作者:郭榮富，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： rongfug@163.com

S852.2

A

1006-267X(2017)06-1996-14