李 銳，金玉蘭，韓一丁，劉紅剛

四種脫鈣液對骨組織HE和免疫組化染色的影響

李 銳，金玉蘭，韓一丁，劉紅剛

脫鈣液；組織脫鈣；HE染色；免疫組織化學(xué)染色

骨是由黏多糖和蛋白纖維構(gòu)成的有機(jī)質(zhì)及沉積于其中的無機(jī)鹽組成，無機(jī)鹽主要是羥基磷灰石結(jié)晶，其中大部分為磷酸鈣和碳酸鈣；由于骨的特殊構(gòu)成，使骨組織質(zhì)地較硬，較難制成切片影響診斷工作，因此制片過程中必須對其脫鈣。目前臨床工作中較常見的脫鈣液是復(fù)合酸類脫鈣液，是將2種或2種以上酸類脫鈣液聯(lián)合使用，或在單純酸內(nèi)加入另一種脫鈣液或少量的其他試劑配制而成，能使骨組織中難溶于水的羥基磷灰石快速轉(zhuǎn)化為易溶于水的酸式磷酸鹽、氯化鈣等，從而使標(biāo)本軟化。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道[1-4]配置4種不同成分的脫鈣液，通過對舌骨及股骨頭組織進(jìn)行脫鈣，比較4種脫鈣液的優(yōu)缺點(diǎn)，為今后的病理技術(shù)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2015年5月～2016年5月我院手術(shù)室送檢全喉切除標(biāo)本30例、股骨頭組織20例。

1.2 脫鈣液配制 A液：濃鹽酸20 mL加入50 mL的10%中性福爾馬林中，再加入30 mL自來水，制成20%鹽酸甲醛液；B液：取A液100 mL加入10 g氯化鈉，制成20%氯化鈉鹽酸甲醛液。C液：30 mL鹽酸加入70 mL的10%中性福爾馬林，制成30%鹽酸甲醛液；D液：取C液100 mL加入2 mL冰醋酸制成醋鹽酸甲醛液。

1.3 實(shí)驗(yàn)所用儀器及試劑 日本Tissue-Tek VIP全自動脫水機(jī)；德國Leica EG1150H石蠟包埋機(jī)、Leica2245輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)；日本Tissue-Tek Prisma全自動染色機(jī)、Tissue-Tek Film全自動膠片封片機(jī)。10%中性福爾馬林及染色的脫蠟液、透明液、乙醇、伊紅、Harris蘇木精試劑，均購自九州柏林公司；濃鹽酸購自北京化工廠。免疫組化采用EnVision法染色；一抗CD61、CD68、CD235a、Ki-67，均購自福州邁新公司；二抗EnVision試劑盒，購自北京中杉金橋公司。

1.4 方法

1.4.1 脫鈣方法 新鮮組織及時(shí)用10%中性福爾馬林固定24 h，每例舌骨分別取8～12塊，股骨頭每例取16～20塊，分別制成大小0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm～1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm標(biāo)本，并做好標(biāo)記。上述所有骨組織分別分成4份，并確定每份所含骨組織與另外3份成分基本相同，分別放入A、B、C、D四種脫鈣液中，在室溫下進(jìn)行脫鈣，每24 h更換脫鈣液。

1.4.2 脫鈣終點(diǎn)判定及脫鈣后處理 每間隔1 h觀察1次，標(biāo)本以手感有彈性、大頭針能輕松刺入為脫鈣完成，所有標(biāo)本脫鈣后均放入自來水中沖洗30 min，再放入脫水機(jī)中脫水處理，第2天石蠟包埋，切片4～6 μm厚，70 ℃烤箱烤片30 min，行常規(guī)HE染色，全自動封片機(jī)封固。

1.4.3 免疫組化染色 選取4例舌骨組織70 ℃拷片40 min，脫蠟后放入3%H2O2封閉10 min，pH 6.0的檸檬酸抗原修復(fù)液高壓鍋修復(fù)2.5 min，滴加一抗，37 ℃孵育60 min，經(jīng)免疫組化EnVision法染色，37 ℃孵育15 min，DAB顯色，核復(fù)染、脫水、透明、封固。

2 結(jié)果

2.1 脫鈣時(shí)間 不同組織采用不同的脫鈣時(shí)間，對于舌骨組織D液(醋鹽酸甲醛液)用時(shí)最短，其余脫鈣液時(shí)間：A液(20%鹽酸甲醛液)>B液(20%氯化鈉鹽酸甲醛液)>C液(30%鹽酸甲醛液)。股骨頭的松質(zhì)骨在C液和D液中用時(shí)較短，而在A液中用時(shí)較長；密質(zhì)骨在A液和B液中用時(shí)最長，而在D液中用時(shí)最短(表1)。

表1 不同骨組織脫鈣時(shí)間

2.2 組織的酸化程度 組織經(jīng)B液脫鈣后大體變化不明顯，經(jīng)另外3種脫鈣液處理后短期變化不明顯，但時(shí)間超過24 h后組織會輕微發(fā)黃，時(shí)間越長發(fā)黃現(xiàn)象越嚴(yán)重。

2.3 切片質(zhì)量 經(jīng)4種脫鈣液脫鈣后所有骨組織基本均能完整切片，但經(jīng)A液和B液處理后的組織，切片過程中部分會有沙粒感，尤其是股骨頭密質(zhì)骨在切片時(shí)感覺較硬，切片刀磨損嚴(yán)重，肉眼和鏡下均能看見比較明顯的刀痕；經(jīng)C液和D液脫鈣后的組織能完整制片，且經(jīng)D液脫鈣后的組織，切片時(shí)組織相對較軟，更易切片。

2.4 HE染色效果 經(jīng)A液和B液脫鈣后股骨頭密致骨切片不平整，鏡下刀痕明顯，厚薄不均現(xiàn)象常見，且經(jīng)A液處理后核染色發(fā)紅現(xiàn)象明顯，部分核結(jié)構(gòu)不清，但是經(jīng)B液處理后HE染色核呈紫藍(lán)色、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)對比鮮明；經(jīng)C液和D液脫鈣后的組織鏡下骨組織較平整，骨板結(jié)構(gòu)清晰(圖1)，C液處理后的組織高倍鏡下可見部分核紅染、核結(jié)構(gòu)模糊，核質(zhì)對比不清晰；經(jīng)D液處理后的組織核呈紫藍(lán)色、發(fā)紅現(xiàn)象較少見，核仁結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)對比明顯(圖2)。

2.5 免疫組化染色效果 經(jīng)4種脫鈣液處理后，CD68、CD61、CD235a、Ki-67在骨髓中的表達(dá)：CD68、CD235a表達(dá)差異不大；CD61在A液、B液和D液中表達(dá)均較好，呈棕黃色細(xì)胞質(zhì)陽性(圖3)，而在C液中表達(dá)較模糊，染色較淡，甚至呈陰性。Ki-67在B液和D液中呈較強(qiáng)的核陽性(圖4)，在A液和C液液中均呈局灶陽性。

①②③④

圖1 經(jīng)C液脫鈣的股骨組織：可見骨組織平整，骨板結(jié)構(gòu)清晰 圖2 經(jīng)D液脫鈣的股骨組織：核藍(lán)染，核質(zhì)對比明顯，核仁清晰 圖3 經(jīng)B液脫鈣的舌骨骨髓組織：CD61呈陽性，EnVision法 圖4 經(jīng)D液脫鈣的舌骨骨髓組織：Ki-67呈陽性，EnVision法

3 討論

脫鈣是應(yīng)用化學(xué)或物理的方法將骨組織中的鈣鹽與膠原纖維分離，去除其中較硬的鈣鹽成分，保留完整的膠原纖維。目前需要尋找一種既能有效、快速去除骨組織中的鈣鹽成分，又能很好的保護(hù)骨組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的脫鈣液。

濃鹽酸是一種強(qiáng)酸，為無機(jī)酸，具有極強(qiáng)的揮發(fā)性，與骨組織中鈣鹽結(jié)合后可加速脫鈣，對組織收縮小，脫鈣均勻完整，能較好保存骨及骨髓組織中的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是骨及骨髓組織的理想脫鈣液[5]；且低濃度鹽酸能較好的保持骨組織和骨髓組織的抗原性[6]，是骨及鈣化組織進(jìn)行免疫組化染色良好的脫鈣液。10%中性福爾馬林是日常工作中尤其是免疫組化常用的固定液，對組織滲透力強(qiáng)、收縮小，能使大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，由于中性福爾馬林中加入磷酸緩沖液，不易被氧化，故對組織標(biāo)本的固定(特別是長期固定)、 染色效果非常有利[7]。不同濃度的鹽酸甲醛液在對骨組織脫鈣的同時(shí)又能起固定作用，從而減少組織的固定及前期處理時(shí)間。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以往的工作經(jīng)驗(yàn)選擇2種不同濃度的鹽酸甲醛液作為基礎(chǔ)液，再參照以前的研究成果[8-9]，分別加入氯化鈉和冰醋酸，分析幾種脫鈣液的脫鈣效果。

通過對50例骨組織的脫鈣分析，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種脫鈣液基本都能完全脫鈣，其中A液和B液脫鈣速度較慢，D液脫鈣速度較C液快，且經(jīng)D液處理后的組織切片較平整，核染色較清晰，核質(zhì)對比明顯，免疫組化染色相對較穩(wěn)定，可能與醋酸的加入有關(guān)。醋酸本身也是一種固定液，其穿透力強(qiáng)，可促進(jìn)脫鈣液和甲醛固定液在組織內(nèi)的滲透速度，加速脫鈣[10]，同時(shí)醋酸具有使組織尤其是膠原纖維和纖維蛋白膨脹的作用，但通過其他溶液的稀釋，其副作用會明顯降低，并且可抵消鹽酸、甲醛的收縮作用，維持組織細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和形態(tài)[11]。除此之外，醋酸對染色體具有固定作用，能較好地保存染色體結(jié)構(gòu)，減少酸對細(xì)胞核的破壞。

本實(shí)驗(yàn)中C液和D液的脫鈣時(shí)間相差不大，但都比A液快，提示較高濃度的鹽酸甲醛液能加快骨組織的鈣溶解，提高脫鈣速度。Yamamoto-Fukud等[12]也認(rèn)為酸類濃度越高、脫鈣時(shí)間越短，但是曹穎[9]發(fā)現(xiàn)不同酸濃度的脫鈣液其脫鈣時(shí)間和效果相差不大，這可能與選擇較低濃度鹽酸且濃度之間的差異不大有關(guān)(5%～8.5%)。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)B液脫鈣后脫鈣液顏色改變不明顯，組織塊顏色不發(fā)黃，HE染色切片透亮，核呈紫藍(lán)色、細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)對比明顯，且脫鈣速度和效果以及免疫組化染色均較A液效果好，說明氯化鈉在加快脫鈣速度的同時(shí)又能降低酸對組織的破壞，保護(hù)細(xì)胞抗原，這可能是由于氯化鈉降低溶液中離子的活度，導(dǎo)致骨組織中無機(jī)鹽(羥基磷灰石)的溶解度增加、膠原的酸解程度降低，保證脫鈣骨組織的結(jié)構(gòu)完整性[9]。脫鈣后脫鈣液顏色變黃，組織塊顏色變淺黃，提示組織酸化將影響HE及免疫組化染色[13]，這在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。因此，對于較大的骨組織脫鈣前應(yīng)將其鋸成薄片的小塊組織，利于脫鈣液的滲透，加快脫鈣速度，減少組織的酸化。

本組中經(jīng)A液和C液處理后的組織，雖然均能完整切片，但部分組織核染色發(fā)紅現(xiàn)象明顯，有時(shí)會出現(xiàn)核模糊、核仁結(jié)構(gòu)不清的現(xiàn)象，免疫組化染色不穩(wěn)定，不利于診斷。另外A液染色所用時(shí)間較長，特別是對于密質(zhì)骨，所需時(shí)間更長，而且長時(shí)間脫鈣后組織酸化較嚴(yán)重，核質(zhì)對比差，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)欠清晰，因此對于質(zhì)地較硬的密質(zhì)骨其應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度的鹽酸脫鈣速度較快，HE切片效果較佳，尤其是醋鹽酸甲醛液，其配方簡單，所需試劑在日常工作中較易獲得，是一種較為理想的脫鈣液，但是高濃度的酸會破壞組織及細(xì)胞的抗原性，在今后的實(shí)際工作中應(yīng)加以注意，使用高濃度的酸進(jìn)行脫鈣的標(biāo)本，應(yīng)考慮到免疫組化染色假陰性的可能。

20%氯化鈉鹽酸甲醛液對組織的損傷小，HE染色效果好，組織切片透亮，核結(jié)構(gòu)清晰，免疫組化染色較穩(wěn)定，雖然對于較硬的組織其脫鈣耗時(shí)相對較長，但對于較疏松的骨組織及含大量造血細(xì)胞的骨髓穿刺標(biāo)本仍然是一種較好的選擇。

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李 銳，女，碩士，技師。Tel:(010)58268683, E-mail：151675007@qq.com 劉紅剛，男，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，通訊作者。Tel:(010)58268685，E-mail： liuhg1125@163.com

時(shí)間：2017-5-17 23:54 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.028.html

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1001-7399(2017)05-0579-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.028

接受日期：2017-02-24