韓艷春，張 騫，曹 璋，劉魯英

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Livin和MMP-7的表達(dá)及臨床意義

韓艷春，張 騫，曹 璋，劉魯英

目的 檢測凋亡抑制蛋白家族新成員Livin和基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metallo proteinase 7, MMP-7)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)，探討兩者表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義。方法 采用免疫組化SP法檢測Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁乳腺組織中的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性及其與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理特征的關(guān)系。進(jìn)一步應(yīng)用Western blot法檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其相應(yīng)的癌旁乳腺組織中Livin和MMP-7蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁乳腺組織中的陽性率分別為65%vs10% 和73.3%vs25%，且兩者在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的陽性率均高于癌旁乳腺組織(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Livin表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期具有正相關(guān)性(P<0.05)，MMP-7表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)均具有正相關(guān)性(P<0.05)。Livin與MMP-7表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.322，P=0.007)。Western blot結(jié)果也表明，Livin與MMP-7蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)水平均高于癌旁乳腺組織。結(jié)論 Livin和MMP-7表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，兩者可能具有協(xié)同作用促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)展演進(jìn)。

乳腺腫瘤；Livin；MMP-7；病理特征；免疫組織化學(xué)

目前，乳腺癌的發(fā)病率已位居女性惡性腫瘤的首位，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌是其最常見的類型，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的死亡人數(shù)較多。已有研究表明，凋亡抑制蛋白家族的新成員Livin和基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metallo proteinase-7, MMP-7)在多種人類惡性腫瘤中呈高表達(dá)。有報(bào)道顯示干擾Livin表達(dá)可調(diào)控MMP-2、MMP-9抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，兩者在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)相互關(guān)系尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在分析乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Livin和MMP-7的表達(dá)，探討兩者表達(dá)的相互關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔60例乳腺癌組織及20例癌旁乳腺組織標(biāo)本，其中60例乳腺癌組織蠟塊標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。所有患者均為女性，年齡28～75歲。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(2009)乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期[1]：Ⅰ期16例，Ⅱ期27例，Ⅲ期17例；按Scarff-Bloom-Richardson組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]：Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)35例，Ⅲ級(jí)14例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。另收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲乳外科手術(shù)切除的16對新鮮原發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和相應(yīng)癌旁組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于提取乳腺組織中的總蛋白。所有乳腺癌患者于手術(shù)前均未采取任何化療等輔助治療，并簽署知情患者同意書。

1.2 試劑 Livin兔抗人的多克隆抗體購自武漢博士德公司，MMP-7鼠抗人的單克隆抗體、GAPDH鼠抗人的單克隆抗體、免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光液購自Thermo公司。

1.3 免疫組化 采用免疫組化SP法檢測Livin和MMP-7在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁乳腺組織中的表達(dá)。乳腺組織標(biāo)本經(jīng)連續(xù)切片制成4 μm厚組織切片，切片經(jīng)烤片后二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水處理，并應(yīng)用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。Livin抗體(工作濃度為1 ∶50)和MMP-7抗體(工作濃度為1 ∶100)4 ℃孵育過夜。用設(shè)已知的Livin和MMP-7陽性乳腺癌切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 免疫組化結(jié)果判定采用陽性細(xì)胞的比例和細(xì)胞染色強(qiáng)度相結(jié)合的方法。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野下計(jì)100個(gè)乳腺癌細(xì)胞，按陽性細(xì)胞百分比判斷：無陽性細(xì)胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按細(xì)胞的染色強(qiáng)度判斷：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以兩者相乘所得分?jǐn)?shù)作為其最終得分，得分≥2分則為陽性；<2分為陰性。

1.5 Western blot法 在新鮮的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和相應(yīng)的癌旁乳腺組織中加入RIPA裂解液于冰上進(jìn)行孵育處理提取乳腺組織中的總蛋白，并采用Bradford法進(jìn)行總蛋白濃度的測定。以60 μg總蛋白上樣，于10%SDS-PAGE中電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，分別用Livin和MMP-7抗體(稀釋比例均為1 ∶500)，GAPDH抗體(稀釋濃度為1 ∶1 500)孵育，4 ℃過夜。次日，加以相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，于室溫孵育2 h，ECL發(fā)光并拍照。采用Image J軟件進(jìn)行結(jié)果條帶灰度值測定，以與內(nèi)參GAPDH的比值作為Livin和MMP-7的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Chi-Square檢驗(yàn)分別對Livin和MMP-7的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)對Livin和MMP-7表達(dá)的免疫組化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin和MMP-7的表達(dá) 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin和MMP-7陽性染色顆粒均主要定位于乳腺癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，其陽性率分別為65%(39/60)、73.3%(44/60)。20例癌旁乳腺組織中僅有2例Livin呈陽性；MMP-7在癌旁乳腺組織中有5例呈陽性。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin和MMP-7的表達(dá)均高于癌旁乳腺組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

表1 Livin和MMP-7在不同乳腺組織中的表達(dá)

①A①B②A②B

圖1 A.Livin蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈陽性，SP法；B.Livin蛋白在癌旁乳腺組織中呈陰性，SP法 圖2 A.MMP-7蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈陽性，SP法；B.MMP-7蛋白在癌旁乳腺組織中呈陰性，SP法

2.2 Livin和MMP-7表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的臨床病理特征關(guān)系 采用免疫組化SP法檢測60例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin和MMP-7的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床病理特征關(guān)系。結(jié)果顯示：Livin表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P=0.07，P=0.002)；Livin的表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者年齡、腫瘤大小及組織學(xué)分級(jí)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MMP-7表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性(P=0.08，P=0.013)；與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者年齡、腫瘤大小及TNM分期差異無顯著性(P>0.05，表2)。

2.3 Western blot檢測 進(jìn)一步采用Western blot法檢測16對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及其相應(yīng)的癌旁乳腺組織中Livin和MMP-7蛋白的表達(dá)，其結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，即乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin和MMP-7蛋白表達(dá)水平均高于其相應(yīng)的癌旁乳腺組織(圖3)。

2.4 Livin和MMP-7蛋白表達(dá)的相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示，Livin陽性的39例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中有33例MMP-7也呈陽性，即兩者同時(shí)陽性者33例；Livin陰性的21例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中有10例MMP-7亦呈陰性，即兩者同時(shí)陰性者10例。應(yīng)用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)對Livin和MMP-7表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者具有明顯正相關(guān)性(r=0.322，P=0.007，表3)。

圖3 Western blot法Livin、MMP-7在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及癌旁乳腺組織中的表達(dá)：T.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織；N.癌旁乳腺組織

表2 Livin和MMP-7表達(dá)與乳腺浸潤性

表3 Livin和MMP-7表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

Livin是由不同的研究小組在同一時(shí)期，根據(jù)IAP同源序列在人類基因組cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，分別稱其為ML-IAP、Livin、KIAP。Livin基因位于人類染色體20q13.3，該基因含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。Livin蛋白N端含有1個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，C端包含1個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)[3-5]。

Livin自發(fā)現(xiàn)時(shí)就已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，其在細(xì)胞生長、腫瘤進(jìn)展等方面發(fā)揮重要作用。以往研究表明，Livin在人類多種惡性腫瘤中表達(dá)增加，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。Chung等[9]發(fā)現(xiàn)，Livin在正常胃黏膜組織中不表達(dá)或呈弱表達(dá)，并在淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移癌組織中表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織。干擾Livin的表達(dá)后明顯消弱胃癌AGS細(xì)胞的增殖和遷移能力。我們在實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化SP法和Western blot法檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁乳腺組織中Livin的表達(dá)，其結(jié)果為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Livin的蛋白表達(dá)水平高于癌旁的乳腺組織。進(jìn)一步對Livin表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征分析顯示，Livin高表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯正相關(guān)。提示Livin高表達(dá)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌發(fā)展中起促進(jìn)作用，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

MMP是降解基膜和細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白水解酶家族，該家族成員的異常表達(dá)影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[10]，在腫瘤微環(huán)境的形成中也發(fā)揮重要作用。MMP-7是MMP家族中重要的成員，能夠通過促進(jìn)蛋白水解作用，降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)而促進(jìn)多種人類惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[11-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，MMP-7的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Hsu等[14]發(fā)現(xiàn)MMP-7通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)肺癌的侵襲性，還可通過裂解核仁蛋白引起肺癌的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中MMP-7蛋白的表達(dá)高于癌旁乳腺組織，其陽性與乳腺浸潤性導(dǎo)管的組織學(xué)分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性。提示MMP-7蛋白的高表達(dá)可能對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

Lin等[15]通過RNA干擾技術(shù)敲除Livin后，下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，并抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Qu等[16]報(bào)道Livin敲除減弱的胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，同時(shí)伴MMP-2表達(dá)的降低。MMP-7亦為MMP家族的成員，與MMP-2、MMP-9有許多相同的作用，作者推測Livin可通過調(diào)控MMP-7的表達(dá)影響乳腺癌的惡性表型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：Livin和MMP-7蛋白陽性均與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且呈明顯的正相關(guān)性，提示兩者可能在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的轉(zhuǎn)移中呈正向協(xié)同作用，Livin可能通過調(diào)控MMP-7的表達(dá)促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移是個(gè)多因素、多步驟的過程，本實(shí)驗(yàn)初步分析Livin和MMP-7具有正相關(guān)性，是否在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Livin調(diào)控MMP-7的表達(dá)、調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移及兩者具體的關(guān)聯(lián)，還有待于深入的分析。

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濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，煙臺(tái) 264003

韓艷春，女，碩士，講師。Tel:(0535)6913215，E-mail: hychrhl7877@126.com 劉魯英，女，博士，副教授，通訊作者。E-mail: llixq@126.com

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