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        睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表達(dá)及其意義

        2017-06-24 14:12:22馬世榮王映梅郭雙平
        關(guān)鍵詞:睪丸淋巴瘤免疫組化

        馬世榮,王映梅,劉 楊,郭雙平

        睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中EZH2蛋白的表達(dá)及其意義

        馬世榮1,2,王映梅1,2,劉 楊2,郭雙平1,2

        目的 探討睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)中EZH2蛋白的表達(dá)、臨床病理特征及意義。方法 采用免疫組化Ventana Ultra View兩步法檢測(cè)17例睪丸原發(fā)性DLBCL中EZH2蛋白的表達(dá),并結(jié)合文獻(xiàn)分析其病理形態(tài)、診斷及鑒別診斷。采用Sanger法檢測(cè)EZH2 641位點(diǎn)酪氨酸(Y641)突變。結(jié)果 11例腫瘤細(xì)胞類似中心母細(xì)胞,3例腫瘤細(xì)胞類似免疫母細(xì)胞,3例腫瘤細(xì)胞具有間變亞型特點(diǎn)。免疫組化標(biāo)記顯示14例為非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non germinal centre B cell like, non-GCB)型,3例為生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal centre B cell like, GCB)型;其中15例腫瘤細(xì)胞核強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)EZH2蛋白,2例約70%腫瘤細(xì)胞核中等強(qiáng)度表達(dá)EZH2蛋白;未檢測(cè)到EZH2 Y641點(diǎn)突變。隨訪9例患者,中位生存時(shí)間35個(gè)月,EZH2蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 睪丸原發(fā)性DLBCL屬于少見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤,具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)特征,絕大部分為non-GCB型;EZH2蛋白在睪丸原發(fā)性DLBCL過(guò)表達(dá),其有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點(diǎn)。

        睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤;EZH2;臨床病理學(xué)特征;免疫表型;預(yù)后

        原發(fā)性睪丸淋巴瘤(primary testicular lymphoma, PTL)屬于少見(jiàn)的高度侵襲性結(jié)外非霍奇金淋巴瘤,占非霍奇金淋巴瘤的1%~2%,好發(fā)于60歲以上的老年男性[1-2],其中原發(fā)性睪丸彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)占80%~90%。該病例少見(jiàn),診斷較為困難。近年有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶——EZH2蛋白在多種惡性腫瘤包括淋巴瘤中異常表達(dá),有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點(diǎn)[3-4]。本文回顧性分析17例原發(fā)于睪丸的DLBCL相關(guān)資料,探討其臨床病理學(xué)特征及EZH2蛋白表達(dá)的意義。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料 收集2002年1月~2014年3月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院住院治療并有完整臨床資料的17例原發(fā)于睪丸的DLBCL患者(表1);所有病例均在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科經(jīng)病理組織學(xué)和免疫組化染色明確診斷。

        1.2 方法 手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片,行常規(guī)HE及免疫組化Ventana Ultra View兩步法染色。所用抗體包括EZH2(USA)、CD20、CD3、CD21、CD10、BCL-6、MUM1、Ki-67(DAKO公司),采用 Roche Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行染色。

        1.3 結(jié)果判讀 CD3、CD20、CD21、CD10以胞膜彌漫棕黃色顆粒為陽(yáng)性;BCL-6、MUM1、Ki-67、EZH2以胞核內(nèi)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性;同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。其中CD10、BCL-6、MUM1的判讀,需至少大于30%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗體判斷為陽(yáng)性。

        1.4 DNA提取、PCR及測(cè)序 制備5~10 μm厚的組織塊,使用QIAGEN DNA FFPE試劑盒提取基因組DNA。應(yīng)用正向引物:5′-GGCTGGGGGATTTTTATCAA-3′和反向引物:5′-GTTATCAGTGCCTTACCTCTCCA-3′,對(duì)包含EZH2 Y641位點(diǎn)編碼基因的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用相同的引物序列對(duì)正向和反向的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

        2 結(jié)果

        2.1 臨床特點(diǎn) 本組17例原發(fā)睪丸DLBCL患者發(fā)病年齡26~86歲,平均58.8歲,>60歲者10例(占58.8%)。5 例(29.4%)為左側(cè)睪丸受累,9例(52.9%)為右側(cè)睪丸受累,3例(17.6%)為雙側(cè)睪丸受累(表1)。17例患者均未見(jiàn)睪丸外侵犯,首發(fā)癥狀均為患側(cè)睪丸無(wú)痛性腫大。

        2.2 病理檢查 眼觀:多數(shù)腫物界限清楚,少數(shù)腫物與周?chē)M織界限不清。腫物直徑1.5~8 cm,平均5.6 cm,切面灰白、灰黃色,實(shí)性、質(zhì)硬。鏡檢:低倍鏡下,正常睪丸結(jié)構(gòu)被破壞,腫瘤性淋巴細(xì)胞彌漫浸潤(rùn),其中1例發(fā)生大片壞死(圖1)。高倍鏡下,腫瘤細(xì)胞體積較大、中等量胞質(zhì),細(xì)胞核呈圓形,細(xì)胞之間缺乏黏附性。17例中有11例腫瘤細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)2~3個(gè)小核仁,類似于中心母細(xì)胞(圖2),有3例腫瘤細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)1個(gè)居于中央的大核仁,類似于免疫母細(xì)胞。有3例形態(tài)學(xué)上具有間變特點(diǎn),細(xì)胞體積大,細(xì)胞核異型性及多形性更加明顯,可見(jiàn)多核或巨核瘤細(xì)胞,病理性核分裂象多見(jiàn)(圖3)。1例可見(jiàn)睪丸白膜侵犯,1例可見(jiàn)血管受累。

        2.3 免疫表型分型 17例睪丸原發(fā)性DLBCL的腫瘤細(xì)胞均彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)志物CD20(圖4),根據(jù)Hans法對(duì)腫瘤進(jìn)行分型,即根據(jù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD10、BCL-6及MUM1的情況進(jìn)行分型,分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal centre B cell like, GCB)型和非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non-germinal centre B cell like, non-GCB)型。如果腫瘤細(xì)胞CD10呈陽(yáng)性,或僅有BCL-6呈陽(yáng)性,MUM1呈陰性,則為GCB型;如果腫瘤細(xì)胞MUM1呈陽(yáng)性,CD10呈陰性、BCL-6呈陽(yáng)性或陰性,則為non-GCB型。根據(jù)Hans法對(duì)本組17例進(jìn)行分型,其中non-GCB型14例,GCB 型3例(表1)。腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為34%~95%(圖5)。

        表1 17例睪丸原發(fā)性DLBCL的臨床病理特征

        2.4 EZH2蛋白的表達(dá)及突變檢測(cè) 本組均表達(dá)EZH2蛋白(圖6),其中15例腫瘤細(xì)胞核強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)EZH2蛋白,2例約70%腫瘤細(xì)胞中等強(qiáng)度表達(dá)

        ①②③④⑤⑥

        圖1 腫瘤組織周邊可見(jiàn)大片壞死 圖2 腫瘤細(xì)胞體積較大,核圓形,細(xì)胞之間彼此缺乏黏附性,細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)2~3個(gè)小核仁,類似于中心母細(xì)胞 圖3 腫瘤細(xì)胞體積大,細(xì)胞核異型性及多形性更加明顯,可見(jiàn)多核或巨核瘤細(xì)胞,病理性核分裂象易見(jiàn) 圖4 腫瘤細(xì)胞胞膜彌漫表達(dá)CD20,Ventana Ultra View兩步法 圖5 腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為34%~95%,Ventana Ultra View兩步法 圖6 腫瘤細(xì)胞胞核彌漫強(qiáng)表達(dá)EZH2,Ventana Ultra View兩步法

        EZH2蛋白。腫瘤周?chē)鷼埓媲?xì)精管及正常淋巴細(xì)胞不表達(dá)EZH2蛋白。本組均行EZH2的Y641突變檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)突變。

        2.5 治療及預(yù)后 17例患者均進(jìn)行患側(cè)睪丸切除,部分患者術(shù)后按CHOP或R-CHOP方案進(jìn)行化療。9例患者獲得隨訪資料,隨訪時(shí)間5~48個(gè)月,其中3例患者存活,6例患者死亡,中位存活時(shí)間為35個(gè)月(表1)。

        3 討論

        DLBCL是一組異質(zhì)性腫瘤,淋巴結(jié)外DLBCL的發(fā)病機(jī)制、免疫表型、分子遺傳學(xué)特點(diǎn)、治療及預(yù)后可能與發(fā)生于淋巴結(jié)者不同,如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、縱隔原發(fā)性DLBCL在WHO(2008)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類中將其作為特殊類型[5],同時(shí)睪丸原發(fā)性DLBCL預(yù)后差、具有特殊性,目前關(guān)于其臨床病理學(xué)研究較少,特別是缺乏靶向治療的靶點(diǎn)。因此,針對(duì)這一現(xiàn)象,本組檢測(cè)17例睪丸原發(fā)DLBCL中EZH2蛋白的表達(dá)情況,首次發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白在睪丸原發(fā)DLBCL中過(guò)表達(dá),并探討其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系。

        3.1 臨床病理特點(diǎn) PTL于1877年由Malassez[6]首次報(bào)道,占全部睪丸腫瘤的9%,非霍奇金淋巴瘤的1%~2%,發(fā)病率約為0.26/10萬(wàn)[7]。多發(fā)于老年患者,是60歲以上老人睪丸惡性腫瘤中最常見(jiàn)類型[8],其中80%~90%的PTL為DLBCL,本組睪丸原發(fā)性DLBCL患者年齡26~86歲, 60歲以上患者占58.8%,與文獻(xiàn)報(bào)道的好發(fā)年齡一致[9]。5例發(fā)生在左側(cè)睪丸,9例發(fā)生在右側(cè)睪丸,3例雙側(cè)睪丸受累,首發(fā)癥狀均為患側(cè)睪丸無(wú)痛性腫大。

        3.2 組織學(xué)特征 多數(shù)腫瘤與周?chē)M織界限清楚,個(gè)別病例腫瘤浸潤(rùn)周?chē)M織。腫瘤直徑1.5~8 cm,切面呈灰白、灰黃色,實(shí)性、質(zhì)地中等。形態(tài)學(xué)上,腫瘤細(xì)胞體積較大,核圓形,細(xì)胞之間彼此缺乏黏附性,彌漫性浸潤(rùn)睪丸組織。其中14例為中心母細(xì)胞型,3例為免疫母細(xì)胞型,3例具有散在分布的異型性和多形性顯著的腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞體積大,中等量胞質(zhì),核染色質(zhì)粗、細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則、巨核或多核、核膜增厚、核仁明顯、核染色質(zhì)呈空泡狀或粗顆粒狀,具有間變形態(tài)為間變亞型。1例可見(jiàn)大片壞死。

        3.3 EZH2蛋白表達(dá)與基因突變 本組腫瘤細(xì)胞均彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)志物CD20,根據(jù)Hans法對(duì)腫瘤進(jìn)行分型,其中non-GCB型14例(82.3%),GCB 型3例(17.7%),與文獻(xiàn)報(bào)道的睪丸原發(fā)DLBCL的Hans分型以non-GCB型為主相符合[10]。Ki-67增殖指數(shù)為34%~95%,Ki-67增殖指數(shù)與分型無(wú)關(guān)。

        近年研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶——EZH2蛋白的異常表達(dá)和Y641熱點(diǎn)突變與多種惡性腫瘤包括淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[11-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道EZH2蛋白參與前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、惡性膠質(zhì)瘤、原發(fā)髓母細(xì)胞瘤、骨髓惡性腫瘤等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。其中在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤,如DLBCL、濾泡性淋巴瘤、骨髓增生異常、骨髓增生性疾病等腫瘤中均有EZH2的突變或缺失。目前,EZH2的Y641突變已經(jīng)成為淋巴瘤分析的生物學(xué)熱點(diǎn),突變可以增加編碼蛋白的活性,導(dǎo)致H3K27me3水平增高,從而促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的增殖[14-15]。此外,EZH2蛋白還與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性有關(guān)[16],可能是新的腫瘤治療靶點(diǎn)。

        本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化Ventana Ultra View兩步法對(duì)EZH2蛋白進(jìn)行染色,其中15例腫瘤細(xì)胞中EZH2蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性,2例約70%腫瘤細(xì)胞EZH2蛋白呈中等陽(yáng)性,而非腫瘤性淋巴細(xì)胞及殘存曲細(xì)精管不表達(dá)EZH2蛋白。本組結(jié)果表明:與非腫瘤性反應(yīng)性淋巴結(jié)比較,17例睪丸原發(fā)性DLBCL均有EZH2蛋白的過(guò)表達(dá),且腫瘤組織表達(dá)EZH2蛋白水平與腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型無(wú)相關(guān)性。同時(shí),17例組織標(biāo)本均進(jìn)行EZH2 Y641點(diǎn)突變檢測(cè),結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)突變。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在高度侵襲性的淋巴瘤如NK/T細(xì)胞淋巴瘤中,雖然有EZH2蛋白的過(guò)表達(dá),但未改變細(xì)胞內(nèi)H3K3甲基化水平,因此并未出現(xiàn)EZH2基因突變[17]。由此可以推斷EZH2蛋白的過(guò)表達(dá)與是否具有EZH2基因突變無(wú)必然的聯(lián)系。EZH2在腫瘤組織異常表達(dá)可能不依賴于是否有EZH2基因的突變。EZH2抑制劑有望成為DLBCL有效的靶向治療藥物[18-20],且EZH2抑制劑可同時(shí)抑制EZH2突變型和野生型的DLBCL腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。 因此,檢測(cè)腫瘤組織中EZH2蛋白的表達(dá)水平可為EZH2的靶向治療提供依據(jù)。

        3.4 鑒別診斷 睪丸原發(fā)性DLBCL屬于罕見(jiàn)睪丸腫瘤,其組織學(xué)表現(xiàn)與睪丸其他腫瘤有相似之處,且其臨床表現(xiàn)也缺乏特異性,易與其他腫瘤混淆。因此要想明確診斷,必須將臨床表現(xiàn)、組織學(xué)特點(diǎn)及免疫表型相結(jié)合。原發(fā)于睪丸的DLBCL需與以下疾病進(jìn)行鑒別:(1)睪丸精原細(xì)胞瘤,發(fā)病年齡低,平均40歲,鏡下腫瘤細(xì)胞大而一致,胞質(zhì)透明,核仁明顯,腫瘤周?chē)梢?jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)常被破壞。免疫組化染色顯示腫瘤細(xì)胞表達(dá)SALL4、CD117及PLAP,有助于鑒別診斷。(2)慢性睪丸炎,一般由化膿性炎轉(zhuǎn)變而來(lái),鏡下細(xì)胞成分較為混雜,主要為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等多種炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn),鑒別較為容易。(3)胚胎性癌,年輕患者多見(jiàn),典型病變組織學(xué)可以出現(xiàn)乳頭狀或腺管樣結(jié)構(gòu),較易診斷。當(dāng)腫瘤彌漫生長(zhǎng),呈實(shí)體型時(shí)則需與淋巴瘤進(jìn)行鑒別。免疫組化染色腫瘤細(xì)胞表達(dá)CK、SALL4及PLAP,有助于鑒別診斷。

        3.5 治療及預(yù)后 睪丸原發(fā)性DLBCL屬于高度侵襲性的腫瘤,患者的治療主要是行睪丸根治性切除,術(shù)后輔以化療,化療方案主要為CHOP或R-CHOP。本組患者均進(jìn)行患側(cè)睪丸根治性切除,9例患者獲得隨訪資料,隨訪時(shí)間5~48個(gè)月。其中,7例術(shù)后進(jìn)行CHOP或R-CHOP方案的化療,2例未進(jìn)行化療。9例中6例患者死亡,3例患者存活。

        總之,睪丸原發(fā)性DLBCL是一種少見(jiàn)的特殊類型淋巴瘤,具有高度侵襲性,診斷及鑒別診斷均具有一定困難。EZH2蛋白在睪丸原發(fā)性DLBCL中的表達(dá),有望成為分子靶向治療的依據(jù)。

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        Expression and significance of EZH2 protein in primarytesticular diffuse large B cell lymphoma

        MA Shi-rong1,2, WANG Ying-mei1,2, LIU Yang2, GUO Shuang-ping1,2

        (1DepartmentofPathology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofPathology,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

        Purpose To explore the expression and significance of histone methyltransferase EZH2, clinicopathological features in primary testicular diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Methods Immunohistochemical of Ventana Ultra View two-step staining was used to detect expression of EZH2 in 17 cases of primary testicular DLBCL. The relationship between EZH2 expression and its clinicopathological features were analyzed. Sanger squencing was used to detect EZH2 Y641 mutation in these cases. Results Morphologically, the tumor cells resembled centroblasts in 11 cases, immunoblasts in 3 cases, and anaplastic variants in 3 cases. Immunophenotypically, 14 cases were non-germinal centre B cell like (non-GCB) type and 3 cases were germinal centre B cell like (GCB) subtype. EZH2 overexpressed in all 17 cases. EZH2 overexpressed in nearly tumor cells with uniformly strong intensity in 15 cases, and more than 70% tumor cells with moderate to strong intensity in 2 cases. The follow-up information was obtained in 9 patients, with a median survival time of 35 months. No association was found between the level of EZH2 expression and outcome of patients. No mutation of EZH2 Y641 was detected. Conclusion Primary testicular DLBCL is a rare aggressive B cell lymphoma with distinctive clinicopathological features. Detection of EZH2 expected to assist in the diagnosis and treatment of tumor.

        primary testicular diffuse large B cell lymphoma;EZH2; clinicopathological feature; immunophenotype; prognosis

        國(guó)家自然科學(xué)基金(81472597)

        1第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室,西安 7100322第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科,西安 710032

        馬世榮,女,講師。Tel:(029)84773412,E-mail: mashirong_@163.com 郭雙平,女,碩士生導(dǎo)師,副教授,通訊作者。Tel:(029)84773412,E-mail: guoshuangping@163.com

        時(shí)間:2017-5-17 23:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.004.html

        R 737.21

        A

        1001-7399(2017)05-0485-05

        10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.004

        接受日期:2017-03-17

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