甘 藝，吳正升，吳 強

·論 著·

乳腺癌組織中SOX4、EZH2的表達及臨床意義

甘 藝，吳正升，吳 強

目的 觀察上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)調(diào)控因子SOX4和EZH2在乳腺癌組織中的表達，探討兩者的臨床意義。方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測241例乳腺癌組織及126例癌旁非腫瘤乳腺組織中SOX4、EZH2的表達，分析兩者表達的相關(guān)性及其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 乳腺癌組織中SOX4的高表達率為82.2%，顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織的高表達率(57.1%，P<0.05)；EZH2在乳腺癌組織中的高表達率為80.1%，顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織的高表達率(47.6%，P<0.05)。SOX4高表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM高分期、HER-2高表達相關(guān)(P<0.05)；EZH2高表達與腫瘤組織學(xué)高分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性、EGFR陽性、Ki-67高增殖指數(shù)相關(guān)(P<0.05)，并與SOX4表達呈顯著正相關(guān)(rs=0.256，P<0.001)。結(jié)論 EMT調(diào)控因子SOX4和EZH2在乳腺癌組織中表達上調(diào)，兩者可能共同參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移，有望成為預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標志物。

乳腺腫瘤；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；SOX4；EZH2；免疫組織化學(xué)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌患者主要致死原因[2]。因此，探索腫瘤轉(zhuǎn)移的機制、改善乳腺癌患者預(yù)后成為當下研究的熱點。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是早期胚胎發(fā)育過程中上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[3]。SOX4 屬于SOX家族的C亞族轉(zhuǎn)錄因子，能夠間接誘導(dǎo)乳腺上皮細胞發(fā)生EMT，增強細胞的侵襲和遷移能力，從而促進乳腺癌轉(zhuǎn)移，是一種新型的EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子[4]。EZH2是果蠅Zeste基因增強子的人類同源物，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可通過抑制E-cadherin的表達直接誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。本文采用免疫組化EnVision兩步法檢測乳腺癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中SOX4與EZH2的表達，分析兩者表達的相關(guān)性及其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，探討SOX4和EZH2共同調(diào)節(jié)EMT的可能，為預(yù)測乳腺癌患者轉(zhuǎn)移提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2011～2014年女性乳腺浸潤性癌(非特指型)石蠟包埋標本241例，年齡25～90歲，中位年齡50歲。另選取癌旁非腫瘤乳腺組織126例作為正常對照。所有病例術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。由兩位資深病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2012)乳腺腫瘤分類及診斷標準[6]對所有病例進行組織學(xué)分型、分級，并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union International Against Cancer, UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)合作制定的第7版乳腺癌TNM分期系統(tǒng)[7-8]對所有病例進行臨床分期。

1.2 試劑與方法 所有標本均以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。兔抗人SOX4多克隆抗體購自O(shè)rigene公司，兔抗人EZH2單克隆抗體(D2C9)購自Cell Signaling公司；即用型抗體Ki-67(MX006)購自福州邁新公司；即用型抗體ER(EP1)、PR(EP2)、HER-2(UMAB36)、EGFR(UMAB96)、免疫組化通用型EnVision兩步法試劑盒及DAB顯色劑，均購自北京中杉金橋公司。具體操作步驟按試劑盒說明書進行，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 SOX4以胞質(zhì)和(或)胞核出現(xiàn)彌漫均質(zhì)的淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，EZH2以胞核出現(xiàn)彌漫均質(zhì)的淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5個高倍視野觀察，采用半定量評分標準[9-10]判斷。(1)染色強度：無著色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強染色為3分。(2)陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項結(jié)果相乘：0分為陰性組，1～4分為低表達組，分析時將陰性和低表達組合并統(tǒng)計；6～12分為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。樣本率之間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman等級相關(guān)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX4和EZH2在乳腺癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中的表達 乳腺癌組織中，SOX4的表達定位于細胞質(zhì)和(或)細胞核(圖1)，EZH2的表達定位于細胞核(圖2)。SOX4在乳腺癌組織中的高表達率為82.2%，顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織的高表達率(57.1%，P<0.05)；EZH2在乳腺癌組織中的高表達率為80.1%，顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織的高表達率(47.6%，P<0.05，表1)。

①A①B②A②B

圖1 SOX4在乳腺癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中的表達，EnVision兩步法：A. 乳腺癌組織中高表達；B. 癌旁非腫瘤乳腺組織中低表達

圖2 EZH2在乳腺癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中的表達，EnVision兩步法：A. 乳腺癌組織中高表達；B. 癌旁非腫瘤乳腺組織中低表達

2.2 SOX4和EZH2表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中，SOX4高表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM高分期、HER-2高表達均相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、ER、PR、EGFR、Ki-67表達均無關(guān)(P>0.05)。EZH2高表達與腫瘤組織學(xué)高分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性、EGFR陽性、Ki-67高增殖指數(shù)均相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、TNM分期、PR、HER-2表達均無關(guān)(P>0.05，表2)。

2.3 乳腺癌組織中SOX4、EZH2表達的相關(guān)性 乳腺癌組織中，SOX4和EZH2同時高表達168例，兩者同時陰性/低表達18例。經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗，SOX4與EZH2在乳腺癌組織中的表達呈顯著正相關(guān)(rs=0.256，P<0.001，表3)。

3 討論

早期胚胎發(fā)育過程中上皮細胞通過EMT程序獲得間質(zhì)表型，該機制在創(chuàng)傷愈合、組織再生、器官炎癥纖維化、惡性腫瘤進程中也發(fā)揮重要作用。發(fā)生EMT的細胞失去其原有的上皮細胞特性，如細胞極性和細胞間黏附性的降低以及上皮細胞特有標志物E-cadherin表達的下調(diào)、β-catenin表達的移位；同時出現(xiàn)間質(zhì)細胞的特征，如細胞運動力和侵襲力的增加及間質(zhì)細胞特有標志物N-cadherin、vimentin等表達上調(diào)[11]。腫瘤細胞也可通過EMT增加其侵襲性而更易向遠處擴散轉(zhuǎn)移。EMT的發(fā)生需要各種誘導(dǎo)因素的參與，如Snail、Twist、Zeb等轉(zhuǎn)錄因子通過直接抑制E-cadherin表達而誘導(dǎo)EMT發(fā)生[3]；TGF-β、Wnt、PI3K/Akt、MAPK、Src等細胞內(nèi)信號通路也參與其中，而TGF-β信號通路被認為是最重要的EMT誘導(dǎo)信號[12]；近年來，越來越多的研究表明miRNA可以通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路影響EMT程序[3]。各調(diào)控因子之間可以相互影響，共同調(diào)節(jié)EMT程序。

SOX4是一種新型轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎心臟發(fā)育、淋巴細胞成熟和胸腺發(fā)育等生理過程，可通過自身高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合來激活或抑制靶基因的表達[13]，也可與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同調(diào)節(jié)基因的表達。Zhang等[4]報道SOX4能通過間接抑制E-cadherin的表達激活乳腺上皮細胞發(fā)生EMT，進而促進乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示SOX4可能是一個新型的EMT誘導(dǎo)因子。本組實驗結(jié)果顯示SOX4在乳腺癌組織中的高表達率顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織，與文獻報道相符[4]。SOX4高表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示SOX4高表達增加乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，可能與SOX4誘導(dǎo)癌細胞EMT發(fā)生有關(guān)；SOX4高表達還與TNM高分期、HER-2高表達相關(guān)，提示SOX4高表達可能與乳腺癌預(yù)后不良密切相關(guān)。

表1 SOX4和EZH2在乳腺癌及癌旁非腫瘤乳腺組織中的表達

表2 SOX4和EZH2表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 乳腺癌組織中SOX4和EZH2表達的相關(guān)性

EZH2是多梳蛋白抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的重要組成成分，在胚胎發(fā)育、細胞增殖及細胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用，可催化核小體組蛋白H3的第27位賴氨酸(H3K27)發(fā)生三甲基化，甲基化后的H3K27me3可將PRC2復(fù)合物募集到特定的基因位點，進而沉默靶基因的表達[14]。Luo等[5]報道EZH2可通過H3K27me3抑制E-cadherin在喉部鱗狀細胞癌中的表達，直接參與調(diào)控EMT程序，在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本組實驗結(jié)果顯示EZH2在乳腺癌組織中高表達率顯著高于癌旁非腫瘤乳腺組織，與文獻報道相符[15]。EZH2高表達與SOX4相似，均與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示EZH2和SOX4在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中可能存在某種聯(lián)系，兩者可能共同參與乳腺癌EMT過程。EZH2高表達還與腫瘤組織學(xué)高分級、ER陰性、EGFR陽性、Ki-67高增殖指數(shù)等預(yù)后不良指標相關(guān)，提示EZH2高表達可能在乳腺癌分化、增殖過程中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，本實驗結(jié)果顯示癌旁非腫瘤乳腺組織中SOX4和EZH2的高表達率均較高，分析原因可能有以下幾方面：(1)SOX4和EZH2可參與胚胎發(fā)育、細胞成熟、分化等正常生理過程[13-14]，因此在癌旁非腫瘤乳腺組織中兩者均可表達；(2)有研究表明[16]，組織學(xué)形態(tài)正常的癌旁非腫瘤組織分子狀態(tài)常介于良性病變和惡性腫瘤之間，其中一些基因異常表達可預(yù)測腫瘤患者的臨床預(yù)后，這或許能解釋本組中癌旁非腫瘤乳腺組織SOX4和EZH2表達過高的現(xiàn)象，但具體機制還有待進一步探討。

Tiwari等[17]報道SOX4可與EZH2啟動子區(qū)域結(jié)合，促進EZH2表達，增加H3K27me3水平，進而誘導(dǎo)EMT發(fā)生。本組實驗發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中SOX4與EZH2表達呈顯著正相關(guān)，乳腺癌臨床病理特征分析兩者表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示SOX4可能通過調(diào)節(jié)EZH2的表達促進乳腺癌組織中EMT的發(fā)生，在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，乳腺癌組織中SOX4與EZH2的關(guān)系密切，兩者可能共同參與EMT進程。聯(lián)合檢測SOX4和EZH2，有望成為預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)指標。

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Expression of SOX4 and EZH2 in breast cancer and their clinicopathologic significance

GAN Yi, WU Zheng-sheng, WU Qiang

(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To explore the expression of two epithelial-mesenchymal transition (EMT) regulators, Sry-related high mobility group box 4 (SOX4) and enhancer of zeste homo-log 2 (EZH2), in breast cancer tissues and their clinicopatho-logic significances. Methods The expression of SOX4 and EZH2 was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step in paraffin-embedded tissue sections from 241 cases of breast cancer and 126 cases of paracancerous breast tissues. The relationship between their expression and clinicopathologic characteristics was statistically analyzed, and their correlation was also analyzed. Results In breast cancer tissues and paracancerous breast tissues, the high expression rates of SOX4 were 82.2% and 57.1% respectively, while the high expression rates of EZH2 were 80.1% and 47.6% respectively. Their expression in breast cancer tissues was higher than that in paracancerous breast tissues (P<0.05). High SOX4 expression was correlated with lymph node metastasis, high TNM stage, and overexpression of HER-2 (P<0.05), while high EZH2 expression was correlated with high histological grade, lymph node metastasis, ER negativity, EGFR positivity and high poliferation index of Ki-67 (P<0.05). There was a positive correlation between SOX4 and EZH2 expression in breast cancer tissues (rs=0.256,P<0.001). Conclusion EMT regulators SOX4 and EZH2 might be responsible for the metastasis of breast cancer, which are upregulated in breast cancer tissues. They may act as potential biomarkers to predict the metastasis of breast cancer.

breast neoplasm; epithelial-mesenchymal transition; SOX4; EZH2; immunohistochemistry

國家自然科學(xué)基金(81372476、81472493)

安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

甘 藝，女，碩士研究生。E-mail: 1152257631@qq.com 吳 強，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: aydjohn@yahoo.com

時間：2017-5-17 23:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.002.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0477-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.002

接受日期：2017-03-20