丁 暉，李 陽，李 淼

西安交通大學 第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學影像科，陜西 西安 710061

以18F-FDG為輔基的18F-氟標記方法研究進展

丁 暉，李 陽，李 淼*

西安交通大學 第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學影像科，陜西 西安 710061

在核醫(yī)學分子影像領(lǐng)域用于正電子示蹤劑的18F-氟標記方法中，基于含18F-氟中間體分子(即輔基)的方法其反應(yīng)條件溫和、化學選擇性好，產(chǎn)物易純化，是進行18F-氟標記的經(jīng)典策略之一。2-18F-氟代-2-脫氧-D-葡萄糖(2-18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose,18F-FDG)是目前臨床最常用的正電子示蹤劑，其分子結(jié)構(gòu)簡單、親水性強、易獲得，是用于間接18F-氟標記的理想輔基。通過比較其方法學參數(shù)，并分析標記產(chǎn)物性能可知，以18F-FDG為輔基的間接18F-氟標記方法有酶法、成肟法、巰基連接法、“點擊化學”法等，在小分子、肽、酶和納米粒的18F-氟標記研究中均有報道。此外，微流控芯片等新技術(shù)在上述方法中也有應(yīng)用。與18F-FDG連接可方便地同時實現(xiàn)被標記分子糖基化和18F-氟標記，顯著改善標記產(chǎn)物的體內(nèi)分布和消除特性，雖存在反應(yīng)步驟多、被標記分子需修飾等局限，但以18F-FDG為輔基進行18F-氟標記仍是一種具有較高可行性和應(yīng)用價值的間接18F-氟標記策略。

18F-氟代脫氧葡萄糖；輔基；間接標記；18F-氟標記；方法學

正電子發(fā)射斷層成像(positron emission tomography, PET)是通過探測注入體內(nèi)的正電子類放射性核素標記示蹤劑發(fā)射的γ射線信號表征其分布，間接獲知代謝功能、受體分布、基因表達等生理病理信息的先進分子影像技術(shù)。PET的進步主要依靠正電子核素標記示蹤劑(以下簡稱“示蹤劑”)的發(fā)展[1]。 通過引入輔基可修飾示蹤劑分子結(jié)構(gòu)，改變其體內(nèi)分布和消除特性[2-3]。糖基化是最常用的修飾策略之一，其優(yōu)勢在于：(1) 增加水溶性，增加腎消除比例，減少消化系統(tǒng)生理性攝?。?2) 減少內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除，延長靶組織滯留時間；(3) 加快血液清除，縮短注射到成像的時間間隔。存在的問題是：(1) 糖基極性大，可能改變被標記分子的極性分布，并影響其透過血腦屏障的能力；(2) 糖基空間位阻大，可能影響標記產(chǎn)物對靶標的親和力[4]。

2-18F-氟代-2-脫氧-D-葡萄糖(2-18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose,18F-FDG)是目前占主導地位的示蹤劑[5]，其分子結(jié)構(gòu)類似單糖，以18F-FDG為輔基進行18F-氟標記可獲得類似糖基化修飾的效果。1999年以來已有眾多基于18F-FDG制備18F-氟標記示蹤劑的研究報道[6-7]。筆者[8]也曾嘗試采用該策略，對氨基端存在6-肼基煙?；揎椀碾倪M行了18F-氟標記研究，該方法簡便，反應(yīng)迅速，所得腙類產(chǎn)物的標記率接近35%。6-肼基煙酰基是常用于99Tcm-锝標記的輔基，早已實現(xiàn)商品化，故該法具有一定的臨床轉(zhuǎn)化潛力。本工作擬按各方法首次報道時間為序歸納相關(guān)進展，以期協(xié)助后續(xù)研究選擇適當?shù)姆磻?yīng)類型。

1 酶法

Prante等[9]首次報道的以18F-FDG為輔基的18F-氟標記研究即采用該法。為了規(guī)避酶促反應(yīng)的可逆性影響放射化學產(chǎn)率(radio-chemical yield, RCY)，Prante等以18F-FDG-1-磷酸為底物對三磷酸尿苷(uridine triphosphate, UTP)進行酶促18F-氟標記，制得18F-FDG-二磷酸尿苷(18F-1,圖1)。UTP濃度在0.65 mmol/L時RCY達到最高，且酶濃度升高可加快反應(yīng)。

圖1 18F-氟代二磷酸尿苷結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of 18F-fluoro-uridine diphosphate

Bormans等[10]采用18F-FDG對二磷酸尿苷-半乳糖進行酶促標記，制備2′-18F-氟代脫氧乳糖(18F-2)(圖2)。該反應(yīng)速率慢且RCY低。在野生小鼠和高表達LacZ基因的Rosa-26型小鼠體內(nèi)18F-2的血液清除快，但未見組織攝取，說明18F-2不能跨細胞膜轉(zhuǎn)運，不適用于體內(nèi)成像。

圖2 以18F-FDG為輔基制備的18F-氟代乳糖結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of 18F-fluoro-galactose labeled via 18F-FDG

Phenix等[11]用18F-FDG衍生物標記重組酸性β-葡萄糖腦苷酯酶(GCase)，用于表征Gaucher病模型鼠體內(nèi)GCase分布和代謝動力學的研究。該反應(yīng)較快，但標記產(chǎn)物18F-GCase(18F-3)(圖3)的純化過程冗長。18F-3在小鼠體內(nèi)巨噬細胞富集器官(如肝、脾)中濃聚，主要通過腎和肝膽代謝。腦中無攝取說明未解離出18F-FDG。該方法有潛力發(fā)展成為酶替代型示蹤劑的通用制備方法。

圖3 18F-氟標記酸性β-葡萄糖腦苷酯酶結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structural formula of 18F-fluoro-acid β-glucocerebrosidase

總之，酶法主要利用18F-FDG與葡萄糖結(jié)構(gòu)相似而可被酶選擇性識別的特性，反應(yīng)條件溫和，可保證標記底物和位點的高度選擇性，但也限制了被標記分子的種類。酶法RCY較低，耗時很長，產(chǎn)物難純化，尚不適用于臨床成像。

2 成肟法

成肟法是利用醛/酮羰基與氨氧基在酸性水相體系(pH=4～7)中可選擇性反應(yīng)形成肟的原理。雖然該條件下18F-FDG可開環(huán)暴露醛基(18F-5)，但也易使生物大分子變性。因C=N雙鍵取代基空間位阻的差異會存在E/Z兩種構(gòu)型的產(chǎn)物(18F-7、18F-9)。因水相溶液中吡喃單糖(包括18F-FDG)存在α/β異頭物(18F-4、18F-6)變旋現(xiàn)象，故18F-7和18F-9也處于以呋喃糖(18F-8)為中間體的互相轉(zhuǎn)化平衡中，在高溫(80～120 ℃)和酸性(pH=1.5～2.5)條件下轉(zhuǎn)化迅速，可認為是同一物質(zhì)而無需分離(圖4)。

R：被標記分子圖4 成肟法18F-氟標記的原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of oxime formation in the 18F-fluoro-labeling via 18F-FDG

文獻[12]首次報道了以18F-FDG為起點采用成肟法進行18F-氟標記的研究，即通過順丁烯二酰亞胺基己基肟連接18F-FDG后再與肽或蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基連接成18F-10(圖5)。采用谷胱甘肽驗證方法后Wuest等[13]進行了膜聯(lián)蛋白A5的18F-氟標記研究。該法對膜聯(lián)蛋白A5濃度要求低(2.25 μmol/L)，RCY高，但18F-10純化過程復雜。

R=膜聯(lián)蛋白A5圖5 以18F-FDG-順丁烯二酰亞胺基己基肟為中間體制備的18F-標記膜聯(lián)蛋白A5結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structural formula of 18F-fluoro-annexin A5 labeled via 18F-FDG-maleimidehexyloxime

圖6 以18F-FDG為輔基標記RGD線肽/環(huán)肽的反應(yīng)路線圖Fig.6 Structural formulas of 18F-fluoro-cyclo/linear RGD peptide labeled via 18F-FDG

采用18F-FDG直接對氨氧基修飾肽進行標記的方法由Namavari等[14]和Hultsch等[15]分別報道。Namavari等[14]用18F-FDG分別直接標記氨氧乙?；揎椀木€形和環(huán)形精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽(arginine-glycine-aspartic acid, RGD)(圖6)。18F-FDG-RGD環(huán)肽(18F-12)的IC50=0.67 μmol/L，說明18F-氟標記未影響其活性。標記產(chǎn)物(18F-11、18F-12)分別注入U87MG荷瘤鼠后120 min，腫瘤攝取顯著低于心臟和腎；18F-11的腫瘤/血攝取比高，腫瘤/肝攝取比低；18F-18的腫瘤/肌肉和腫瘤/肝攝取比高，說明18F-11和18F-12非特異性生理攝取過高，不適用于成像。Hultsch等[15]采用臨床18F-FDG標記氨氧基修飾RGD環(huán)肽的研究中以叔丁氧羰基(Boc)保護氨氧基以減少副反應(yīng)，Boc基可自行熱解離(圖6)。采用小體積18F-FDG與高濃度肽反應(yīng)，在肽過量時RCY較高，原因可能是原料18F-FDG所含葡萄糖干擾標記反應(yīng)。用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)分離葡萄糖后標記效果顯著改善。18F-13注入M21荷瘤鼠120 min后，腫瘤/血攝取比高，成像性能尚可。

Wuest等[16]還采用18F-FDG標記了氨氧乙?；揎椛窠?jīng)降壓肽(8—13)片段(NT8-13)單體、二聚體、四聚體(圖7)。其中單體標記產(chǎn)物(18F-14)的RCY最高(80%)，NT8-13聚合程度越高RCY越低，原因可能是多聚體中氨氧基含量相對低。NT8-13濃度越低RCY越低。Wuest等[16]認為18F-FDG開環(huán)醛α位18F-氟取代基可能增加羰基活性，使18F-FDG比葡萄糖更容易與氨氧基反應(yīng)。

圖7 以18F-FDG為輔基對神經(jīng)降壓肽(8—13)片段衍生物單體/二聚體/四聚體進行18F-氟標記的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structural formulas of 18F-FDG-labeled monomeric, dimeric, and tetrameric neurotensin(8-13) derivatives

Simpson等[17]采用18F-FDG標記氨氧乙?；途垡叶蓟揎椀纳锼匮苌锏难芯勘砻?，RCY很高，但標記產(chǎn)物(18F-17)(圖8)比活度較低，且降低前體濃度會影響RCY。使用制得后衰變4 h的18F-FDG，RCY仍能達到近100%。18F-17在體外對親和素的結(jié)合率可達85%，非特異性結(jié)合率不足10%。

Jammaz等[18]采用18F-FDG標記了氨氧基乙酰碳酰肼基修飾葉酸/甲氨蝶呤，標記率高，標記產(chǎn)物18F-FDG-葉酸(18F-18)和18F-FDG-甲氨蝶呤(18F-19)(圖9)的比活度和穩(wěn)定性高。18F-18和18F-19對高表達葉酸受體的KB細胞的親和力優(yōu)于18F-氟苯基或18F-氟吡啶基標記葉酸，與天然酸相當。在正常鼠的血液和組織清除快。KB荷瘤鼠體內(nèi)分布研究顯示，其血液清除快，腫瘤攝取值高，18F-18或18F-19與葉酸共注射后腫瘤和腎的攝取顯著降低，其中18F-19顯示出較優(yōu)越的成像性能。

圖8 以18F-FDG為輔基對生物素衍生物進行18F-氟標記的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structural formula of 18F-FDG-labeled biotin derivatives

圖9 以18F-FDG為輔基對碳酰肼基葉酸/甲氨蝶呤進行18F-氟標記的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.9 Structural formulas of 18F-FDG-labeled carbohydrazide-folate/methotrexate derivatives

Frau等[19]報道了19F-FDG標記氨氧基修飾吡唑類化合物NESS125A用于大麻素(cannabinoid, CB)受體顯像的研究。相比NESS125A，兩種化合物(化合物20、21,圖10)對CB1和CB2受體的親和力及對CB1受體的選擇性都顯著減弱，說明在吡唑基3-位的親水性基團取代會影響NESS125A的活性，故未進行18F-氟標記研究。

圖10 以19F-FDG為輔基對NESS125A衍生物進行 19F-氟標記的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式Fig.10 Structural formulas of 19F-FDG-labeled NESS125A derivatives

總之，成肟反應(yīng)條件相對溫和，RCY高，但被標記分子濃度低會影響RCY。以氨氧基修飾被標記分子可保證標記位點選擇性。以Boc基封閉游離氨氧基可提高標記率。臨床用18F-FDG因含有大量葡萄糖會干擾標記反應(yīng)，使用前應(yīng)采用HPLC純化。

3 巰基連接法

圖11 18F-氟標記CAKAY肽/RGDfC環(huán)肽結(jié)構(gòu)式Fig.11 Structural formulas of 18F-fluoro-CAKAY peptide/cyclo-RGDfC peptide derivatives

Prante等[20]首次以18F-FDG為輔基采用巰基連接法進行18F-氟標記的研究。該法將α-苯磺酸三乙?；?8F-FDG硫酯與含半胱氨酸殘基的CAKAY肽或RGDfC環(huán)肽連接得到標記產(chǎn)物(18F-22、18F-23, 圖11)?？傮w上講反應(yīng)條件溫和，但步驟冗長影響了RCY。在生化和細胞水平，18F-23與RGDfC環(huán)肽相比，半胱氨酸殘基糖基化未顯著影響對αvβ3整合素的親和力。

Boutureira等[21]首次從18F-FDG開始對蛋白質(zhì)進行位點選擇性18F-氟標記的研究。反應(yīng)將1-硫代-18F-FDG與含半胱氨酸或脫氫丙氨酸殘基的枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(SBL-S156C或SBL-S156Dha)連接，分別得到二硫鍵和硫醚鍵連接的標記產(chǎn)物(18F-24、18F-25，圖12)，反應(yīng)條件溫和，RCY較高。

圖12 18F-氟標記枯草桿菌絲氨酸蛋白酶SBL-S156結(jié)構(gòu)式Fig.12 Structural formulas of 18F-fluoro-serine protease subtilisin from Bacillus lentus(SBL) S156

Unak等[22]從四乙?；谆酋８事短情_始對金納米粒進行18F-氟標記的研究。反應(yīng)的RCY和標記產(chǎn)物(18F-26)穩(wěn)定性均較高。18F-26對異粘蛋白高表達的MCF-7細胞有較高親和力和較低毒性。該法的缺點是制備步驟多(圖13)，另外原料NaCNBH3毒性強，對產(chǎn)物純化的要求高。

圖13 以18F-FDG為輔基對制備的18F-氟標記異粘蛋白抗體修飾金納米粒結(jié)構(gòu)式Fig.13 Structural formula of 18F-fluoro-metadherin antibody modified gold nanoparticle labeled via 18F-FDG

Ozkaya等[23]從四乙?；谆酋８事短情_始對磁性氧化鐵納米粒進行18F-氟標記的研究。方法與前述金納米粒相似，最后一步反應(yīng)連接納米粒的產(chǎn)率高(圖14)，但總體RCY仍較低。標記產(chǎn)物(18F-27)對MCF-7細胞有高親和力和低毒性。

圖14 18F-氟標記磁性氧化鐵納米粒結(jié)構(gòu)式Fig.14 Structural formula of 18F-fluoro-magnetic iron oxide nanoparticle labeled

總之，巰基連接法需要被標記分子含有暴露的巰基或含有半胱氨酸殘基，該法的優(yōu)勢在于具有優(yōu)異的位點選擇性，反應(yīng)條件相對溫和，更適用于生物大分子的18F-氟標記。但因反應(yīng)步驟多，反應(yīng)時間偏長，總體RCY值受到一定影響。該法一般選用二硫鍵和硫醚鍵連接18F-FDG輔基，雖然這兩種鍵比酯鍵更難酶解，但其標記產(chǎn)物的體內(nèi)穩(wěn)定性仍有待提高。尚未見該法用于體內(nèi)成像研究的報道。

4 “點擊化學”法

“點擊化學”策略由Sharpless等[24]提出，其條件溫和、化學選擇性好、操作簡便。其中Cu(Ⅰ)催化-疊氮基-炔基環(huán)化加成反應(yīng)(copper(Ⅰ)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC)是最常用的反應(yīng)類型之一[25]。CuAAC已廣泛應(yīng)用到正電子核素標記研究中[26-27]。

Maschauer等[28]首次以18F-FDG為輔基通過CuAAC進行18F-氟標記的研究。先制得18F-FDG-疊氮化物，再與丙炔基甘氨酸連接制得18F-28。該法缺點是反應(yīng)步驟太多(圖15)。Maschauer等[29]還嘗試用類似方法對丙炔基甘氨酸殘基修飾的NT8-13衍生物和RGD環(huán)肽進行18F-氟標記，標記反應(yīng)快，標記產(chǎn)物(18F-29、18F-30)的純度和比活度高。18F-29對NT受體有高親和力(Kd=8.5 nmol/L)和選擇性。18F-29注入HT29荷瘤鼠65 min后，腫瘤/血的放射性攝取比達3.5；18F-30注入U87MG荷瘤鼠體內(nèi)30 min后，腫瘤/血和腫瘤/肌肉的放射性攝取比分別為2.3和4.4。18F-29和18F-30均顯示出良好成像性能。

Boutureira等[30]分別采用四乙?；?18F-FDG-疊氮化物和18F-FDG-疊氮化物對含丙炔基甘氨酸殘基的磷酸丙糖異構(gòu)酶(SsβG)進行18F-氟標記(圖16)，二者都存在標記率低、反應(yīng)時間長的問題，原因可能是通過基因重組和細菌表達制備的SsβG濃度低。采用四乙?；?18F-FDG-疊氮化物的總體RCY較低，反應(yīng)時間較長。

Fmoc：芴甲氧羰基；NLys：N-(4-氨丁基)甘氨酸殘基；Tle：叔亮氨酸殘基圖15 18F-氟標記甘氨酸、神經(jīng)降壓肽(8—13)片段和RGD環(huán)肽衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.15 Structural formulas of 18F-fluoro-glycine/neurotensin(8-13)/cyclo RDGfPra peptide derivatives

SsβG：磷酸丙糖異構(gòu)酶圖16 18F-氟標記磷酸丙糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)式Fig.16 Structural formulas of 18F-fluoro-triosephosphate isomerase barrel protein

Fischer等[31]采用18F-FDG-疊氮化物對丙炔基甘氨酸修飾葉酸進行18F-氟標記的研究。標記產(chǎn)物18F-33(圖17)顯示出良好的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性。18F-33注入KB荷瘤鼠體內(nèi)90 min后，腫瘤/血液放射性攝取比高于36，顯示出優(yōu)異的成像性能。消化系統(tǒng)的非特異性高攝取懷疑與肝細胞的受體介導內(nèi)吞有關(guān)。為增加18F-33的血液滯留時間，F(xiàn)ischer等[32]還在18F-33的基礎(chǔ)上添加了血清白蛋白結(jié)合基團制得18F-34(圖17)。18F-34的總體RCY比18F-33略低，但結(jié)合葉酸受體的選擇性未受影響。在KB荷瘤鼠體內(nèi)，18F-34比18F-33的血液清除慢造成本底偏高，但注射后1 h18F-34的腫瘤攝取和腫瘤/腎放射性攝取比更高。

Hugenberg等[33]采用點擊化學法對異羥肟酸類基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)抑制劑CGS 27023A和CGS 25966進行了多種輔基的19F-氟標記。CGS 25966的兩種19F-FDG標記產(chǎn)物35和36(圖18)對MMP-2、8、9、13均有良好親和力(IC50值為0.2～0.6 nmol/L)，由于標記產(chǎn)物35、36并非所有19F-氟標記產(chǎn)物中IC50和lgD7.4值最佳的產(chǎn)物，故Hegenberg等選擇了其他產(chǎn)物進行18F-氟標記研究。

圖17 18F-氟標記葉酸及其衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.17 Structural formulas of 18F-fluoro-folic acid and its derivatives

Held等[34]合成了一種可選擇性結(jié)合神經(jīng)降壓肽2型受體(neurotensin receptor subtype-2, NTS2)的含N-homo-酪氨酸的NT8-13衍生物，并在其N端連接丙炔基甘氨酸后進行19F-FDG標記。標記產(chǎn)物37(圖19)對NTS2的選擇性和親和力相比被標記分子顯著下降，說明該法制備NTS2示蹤劑不可行，故未進行18F-氟標記研究。

圖18 19F-氟標記CGS 27023A和CGS 25966結(jié)構(gòu)式Fig.18 Structural formulas of 19F-CGS 27023A and 19F-CGS 25966

NLys：N-(4-氨丁基)甘氨酸殘基圖19 19F-氟標記神經(jīng)降壓肽(8—13)片段衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.19 Structural formula of 19F-neurotensin (8-13) derivatives

Banerjee等[35]嘗試對N-芳基哌嗪三唑類化合物進行了多種衍生化和19F-氟標記，并測定了標記產(chǎn)物對多巴胺受體和5-羥色胺受體各亞型的親和力。其中兩種19F-FDG標記產(chǎn)物38和39(圖20)的親水性相對于標記前有不同程度增加，但對多巴胺D4受體的親和力僅相當于被標記分子的1/200和1/10，故未進行18F-氟標記研究。

Maschauer等[36]采用18F-FDG-疊氮化物對丙炔基聚乙二醇修飾的內(nèi)皮素A型受體(endothelin receptor A, ETAR)選擇性配體PD156707進行了18F標記。標記產(chǎn)物18F-40(圖21)對ETAR親和力比ETBR高266倍，但相比PD156707對ETAR的選擇性仍有所降低。為K1移植瘤裸鼠注射18F-40后血液清除快，60 min腫瘤攝取值為0.62%ID/g，肝、腎攝取低，膽囊和腸生理性攝取高，說明18F-FDG標記雖然增加了親水性(lgD=-0.4)，但18F-40仍主要從肝膽清除。

圖20 19F-氟標記N-芳基哌嗪三唑類衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.20 Structural formulas of 19F-N-arylpiperazine triazole derivatives

圖21 18F-氟標記PD156707衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.21 Structural formula of 18F-PD156707 derivatives

Lang等[37]采用18F-FDG-疊氮化物對二芳基吡唑類NTS-1抑制劑SR142948A進行了18F-氟標記。標記產(chǎn)物18F-41(圖22)的水溶性好(lgD7.4=-0.24)，難以透過血腦屏障，對NTS-1的親和力高(Ki=1 nmol/L)。18F-41注入HT29荷瘤鼠體內(nèi)后血液和肝清除快，注射60 min后腫瘤攝取值為0.74%ID/g，腫瘤/血液的放射性攝取比為4.4。相對于其他已報道的NTS-1示蹤劑18F-41的腫瘤攝取值偏低，但腎清除快。

圖22 18F-氟標記SR142948A結(jié)構(gòu)式Fig.22 Structural formula of 18F-SR142948A

Pisaneschi等[38]采用18F-FDG-疊氮化物對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)氰基喹啉類配體進行了18F-氟標記。標記產(chǎn)物18F-42(圖23)的親水性高。分別用高表達/低表達EGFR的A431/MCF7細胞進行體外結(jié)合測定的結(jié)果顯示，18F-42對EGFR有高親和力和選擇性，但18F-42的體內(nèi)分布研究未見報道。

總之，CuAAC并非嚴格意義上從18F-FDG開始的18F-氟標記。另外，疊氮基前體制備過程復雜，需要4步反應(yīng)和HPLC純化[28]，被標記分子還需進行炔基修飾。然而，由于CuAAC在反應(yīng)條件、位點選擇性、產(chǎn)率、反應(yīng)速率、操作便捷性方面具備其他方法難以比擬的優(yōu)勢，目前仍是18F-氟標記方法研究中最熱門的反應(yīng)類型之一，尤其是丙炔基甘氨酸等非天然氨基酸摻入方法發(fā)展成熟后，CuAAC尤其在生物大分子18F-氟標記中的應(yīng)用越來越受到重視。

圖23 18F-氟標記氰基喹啉類化合物結(jié)構(gòu)式Fig.23 Structural formula of 18F-cyanoquinoline

5 其他方法

Patt等[39]借鑒乏氧示蹤劑18F-FAZA的分子結(jié)構(gòu)，從四乙酰基-18F-FDG開始制備18F-FDG與2-硝基咪唑的連接產(chǎn)物18F-43(圖24)。在體外，腫瘤細胞對18F-43的攝取低(0.1%～0.2%)。18F-43注入Walker 256荷瘤大鼠體內(nèi)60 min后腫瘤攝取值與除腎以外的組織相比無顯著差異，故18F-43不適用于體內(nèi)成像，原因尚不明。

圖24 18F-氟標記2-硝基咪唑結(jié)構(gòu)式Fig.24 Structural formula of 18F-fluoro-2-nitroimidazole

Maschauer等[40]從四乙酰基-18F-FDG開始采用三氟化硼(BF3)催化對絲氨酸和蘇氨酸進行側(cè)鏈羥基18F-氟標記(18F-44、18F-45, 圖25)。另外Maschauer等[41]還從標記率的角度對四乙?；?18F-FDG連接絲氨酸/蘇氨酸的兩種方法進行了討論。BF3法適用于N-芴甲氧羰基(Fmoc)絲氨酸，而氫溴酸-三氟甲磺酸銀法適用于N-Fmoc-C-氧芐基蘇氨酸。該研究為氨基酸和肽的側(cè)鏈糖基化18F-氟標記提供了方法學基礎(chǔ)。

圖25 18F-氟標記絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)式Fig.25 Structural formulas of 18F-fluoro-serine/threonine

6 微流控芯片的應(yīng)用

Bouvet等[42]將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于以18F-FDG為輔基對肽進行18F-氟標記的研究，分別驗證了順丁烯二酰亞胺基己基肟法(圖5)和乙?；糠?圖6)。結(jié)果顯示，采用微流控芯片技術(shù)可顯著減少反應(yīng)時間和前體肽用量，并顯著提高RCY。其短時、高溫反應(yīng)的條件更適用于熱不穩(wěn)定性分子的18F-氟標記。

7 問題與對策

以18F-FDG為輔基進行18F-氟標記的優(yōu)勢在于：(1)18F-FDG成本低，易獲取，相比傳統(tǒng)間接18F-氟標記法采用的輔基(如N-丁二酰亞胺基-4-18F-氟苯甲酸酯、4-18F-氟苯甲醛等)，其標記位點選擇性高、合成路線簡單、RCY高；(2) 以18F-FDG為輔基的18F-氟標記反應(yīng)可在水相進行，反應(yīng)體系簡單。該策略的不足之處是：(1) 臨床用18F-FDG所含葡萄糖會干擾標記反應(yīng)，投料前需純化；(2) 其應(yīng)用可能受限于特定類型的前體，或被標記分子需先進行特定修飾(氨氧基、炔基及Boc基等)。

此外，前述各類方法均有技術(shù)難點：(1) 酶法的難點在于酶易失活，操作不便，反應(yīng)的重現(xiàn)性較差，需要精細地控制酶的保存、反應(yīng)和產(chǎn)物純化條件；(2) 成肟法的難點在于反應(yīng)需偏酸性環(huán)境和加熱，故對生物大分子進行標記時反應(yīng)條件需小心控制；有學者開發(fā)了以5-18F-氟代-5-脫氧核糖(5-18F-fluoro-5-deoxyribose,18F-FDR)代替18F-FDG為輔基進行18F標記的方法，采用18F-FDR在室溫和pH=6.0時即可獲得高RCY；此外采用苯胺類化合物催化也可顯著加快反應(yīng)[7,43]；(3) 巰基連接法的難點在于被標記分子上的暴露巰基不穩(wěn)定易氧化，因此反應(yīng)體系需惰性氣體保護和偏堿性環(huán)境；(4) CuAAC的難點在于2-三氟甲磺酰四乙?；B氮前體尚未商品化，故有研究采用6-三氟甲磺?；B氮予以替代；制備四乙酰基-18F-FDG-疊氮化物時，反應(yīng)體系pH值偏高則2-三氟甲磺酰四乙酰基疊氮前體可能分解，可在洗脫18F-F-的K2CO3溶液中加入適量KH2PO4調(diào)整pH值；另外炔基修飾的被標記分子濃度(應(yīng)大于33 μmol/L，生物大分子有時難以達到)會影響標記率[28]；CuAAC需要Cu+催化，引入有毒的重金屬離子為產(chǎn)物純化和質(zhì)量控制帶來不便，故有學者發(fā)展了非銅催化環(huán)化加成以及其他生物正交反應(yīng)類型，體現(xiàn)出良好的前景。

目前尚無任何一種前述反應(yīng)類型適用于所有被標記分子，前述各類方法各有優(yōu)勢(方法學參數(shù)對比見表1)。例如以18F-FDG為輔基對RGD環(huán)肽進行18F-氟標記分別有成肟法、巰基連接法和“點擊化學”法的研究報道，“點擊化學”法制備總耗時最短(70 min)，成肟法RCY最高(可達93%)，巰基連接法反應(yīng)條件最溫和，需根據(jù)實際條件和需求選擇。尤其是成肟法和“點擊化學”法仍不斷有新的改進見諸報道，哪種方法更具有臨床應(yīng)用價值尚無定論。

藥物質(zhì)量控制是標記方法開發(fā)需考慮的重要因素。理想的標記方法應(yīng)盡可能少的引入毒性原料(如NaCNBH3、重金屬、有機溶劑等)，產(chǎn)物與原料、副產(chǎn)物易分離，純化過程簡便快速。前述方法中僅個別涉及毒性原料，多數(shù)方法反應(yīng)步驟多，體系較復雜，故大多采用HPLC結(jié)合固相萃取法進行終產(chǎn)物純化，可有效克服副產(chǎn)物對標記產(chǎn)物結(jié)合靶標的干擾，但缺點是分離時間太長會影響產(chǎn)物比活度。

總而言之，以18F-FDG為輔基進行18F-氟標記是一種可行的間接標記策略。隨著步驟更簡單、條件溫和的新反應(yīng)類型被開發(fā)應(yīng)用、新型靶向分子的發(fā)現(xiàn)和合成設(shè)備的進步，以18F-FDG為輔基的間接18F-氟標記法還將繼續(xù)發(fā)展并逐步向臨床應(yīng)用靠近。如何繼續(xù)提高標記率，減少反應(yīng)步驟、反應(yīng)時間和前體用量將是未來研究關(guān)注的重點方向。

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Methodological Progress of18F-Fluoro-Labeling Employing18F-FDG as Prosthetic Group

DING Hui, LI Yang, LI Miao*

Department of Radiology, the First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

In the field of nuclear medicine molecular imaging,18F-fluoro-labeling methods based on intermediate molecule containing18F-fluoro (i.e. prosthetic groups) has mild reaction condition, fine chemo-selectivity and simple purification for product. Therefore, the indirect18F-fluoro-labeling via prosthetic group is a classical strategy in the development of tracers for positron emission tomography(PET). 2-18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose (18F-FDG), which has simple scaffold, high hydrophilicity and easy accessibility, is the most popular tracer in PET practice and ideal prosthetic molecule for18F-fluoro-labeling. In this paper, we review related methodological progress in literatures. The methodological parameters and product properties in these reports are compared and analyzed. Overall, several18F-fluoro-labeling solutions employing18F-FDG have emerged, including enzymic method, oxime formation, sulfydryl ligation and click-chemistry. They were tried in the18F-fluoro-labeling of small molecules, peptides, enzymes and nanoparticles. New technology such as microfluidic reactor was applied in some solutions aforementioned. Glycosylation and18F-fluoro-labeling of precursor molecule can be achieved synchronically by the conjugation with18F-FDG. Consequently, theinvivobio-kinetics of labeling product are significantly improved. Although the18F-fluoro-labeling employing18F-FDG needs multi-step reaction and especial modification in precursor, it is generally a feasible and valuable indirect labeling strategy.

18F-FDG; prosthetic group; indirect labeling;18F-fluoro-labeling; methodology

2016-05-03；

2016-09-05

西安交通大學第一附屬醫(yī)院科研基金青年創(chuàng)新項目(2014YK8)

丁 暉(1970—)，男，山東曹縣人，主管技師，研究方向為醫(yī)學影像技術(shù)，E-mail: 2330996003@qq.com

*通信聯(lián)系人：李 淼(1983—)，男，陜西安康人，博士，助理研究員，研究方向為分子影像與分子探針，E-mail: 43086906@qq.com

R811.3

A

0253-9950(2017)03-0193-15

10.7538/hhx.2017.39.03.0193