陳 娟， 林玉壁， 尹更生， 李自成， 陳萬群△, 胡 娟， 譚琳琳， 許少玲， 鄭冬玲， 潘涌泉

(1暨南大學基礎醫(yī)學院生物化學和分子生物學系， 廣東 廣州 510632； 2廣東省心血管病研究所， 廣東 廣州 510080； 暨南大學附屬第一醫(yī)院 3臨床檢驗中心， 4心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510632； 5暨南大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)， 廣東 廣州 510632)

血清ACE2水平在冠心病發(fā)生發(fā)展中的變化*

陳 娟1， 林玉壁2， 尹更生3， 李自成4， 陳萬群1△, 胡 娟5， 譚琳琳5， 許少玲5， 鄭冬玲5， 潘涌泉5

(1暨南大學基礎醫(yī)學院生物化學和分子生物學系， 廣東 廣州 510632；2廣東省心血管病研究所， 廣東 廣州 510080； 暨南大學附屬第一醫(yī)院3臨床檢驗中心，4心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510632；5暨南大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)， 廣東 廣州 510632)

目的： 通過檢測血清血管緊張素轉換酶2(ACE2)水平，分析ACE2與冠心病(CHD)不同病程之間的相關性，探討其在CHD發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律。方法: 選取非CHD對照組樣本85例，CHD樣本174例,并按照冠狀動脈狹窄嚴重程度分成輕度(<50%)狹窄組(ls-CHD組)、中度(50%～75%)狹窄組(ms-CHD組)和嚴重(≥75%)狹窄組(ss-CHD組)。通過ELISA檢測所有樣本血清中ACE2水平，統(tǒng)計分析CHD不同病程下的ACE2水平，從而探討血清ACE2水平與CHD發(fā)生發(fā)展間的關系。結果: ls-CHD、ms-CHD和ss-CHD組血清ACE2水平均高于非CHD組，并且隨著冠狀動脈狹窄嚴重程度的加深而上升。男性血清ACE2水平要比女性的高。單一性別內(nèi)，ls-CHD、ms-CHD和ss-CHD組血清ACE2水平均高于非CHD組，并有顯著性差異。回歸分析發(fā)現(xiàn)性別、糖尿病、CHD與血清ACE2水平相關，并且性別和CHD是血清ACE2水平的獨立影響因素。結論: 男性血清ACE2水平高于女性;與非CHD患者相比，CHD患者血清ACE2水平升高;在CHD發(fā)生發(fā)展過程中，血清ACE2水平隨CHD病情的惡化而持續(xù)升高。

血清； 血管緊張素轉換酶2； 冠心病

冠心病(coronary heart disease,CHD)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱， 是由于冠狀動脈狹窄或者供血不足而引起的心肌功能障礙的一種器質(zhì)性病變，是心血管系統(tǒng)中最常見、最主要的疾病[1]。目前它已經(jīng)是是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的首要病因。

血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)于2000年被發(fā)現(xiàn)，打破了腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)代謝通路中血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)-血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)-血管緊張素Ⅱ1型受體 (AT1受體)軸起主要生物效應的傳統(tǒng)觀點，發(fā)現(xiàn)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸與ACE-AngⅡ-AT1軸起著對抗平衡作用[2]。ACE2/Ang-(1-7)信號已被證明可以防止細胞的增殖、病理性肥大、氧化應激、血管纖維化等，ACE2有望在心血管疾病新療法中扮演重要角色，一些臨床用藥可通過ACE2/Ang-(1-7)發(fā)揮作用[3-4],ACE2催化AngⅡ生成Ang-(1-7)的代謝過程在冠心病防護方面扮演重要作用[5]。此外，國內(nèi)也有一些ACE2與冠心病相關的研究[6]。但是，目前為止，血清ACE2水平與CHD患者病情變化之間的關系，尚缺乏深入研究。本研究擬通過檢測不同病情CHD患者血清中ACE2的水平，明確血清ACE2水平與CHD患者病情變化之間的關系，為CHD在臨床上的診斷治療提供一個可供參考的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

選取2014年6月～2016年5月暨南大學附屬第一醫(yī)院診斷明確、廣東地區(qū)漢族無血緣關系的診斷為患有CHD的患者共174例, 男103例, 女71例。其診斷和分型依照1999 年WHO/WPR標準, 所有患者均接受彩色多普勒超聲、常規(guī)12導聯(lián)心電圖或運動心電圖、動態(tài)心電圖檢查, 部分病例行心臟彩超、冠狀動脈造影或64 層螺旋CT冠狀動脈血管成像。所有患者化驗HbA1c、血脂、腎功能等;記錄血壓、體重指數(shù)。CHD患者按照冠狀動脈造影或64 層螺旋CT冠狀動脈血管成像中記錄的冠狀動脈[主要考察左前降支(left anterior descending,LAD)、左旋支(left circumflex coronary artery,LCX)、右冠支 (right coronary artery,RCA)，按三支中狹窄程度最嚴重記]狹窄嚴重程度分為輕度狹窄(light stenosis-CHD,ls-CHD；狹窄程度<50%)組、中度狹窄(mo-derate stenosis,ms-CHD；狹窄程度50%～75%)組和嚴重狹窄(serious stenosis-CHD,ss-CHD；狹窄程度≥75%)組。正常對照組85例樣本, 經(jīng)詳細的病史詢問、體格檢查以及胸片、標準12 導聯(lián)心電圖、B超、血尿糞常規(guī)、血生化檢查均未見異常，為非CHD(non-CHD)樣本， 男36例，女49例。收集并統(tǒng)計分析所有研究對象的一般臨床資料，并于當天收集臨床檢查后所余血清，血清分裝后于-80 ℃保存，用于測定血清中ACE2水平。

2 血清中ACE2檢測

使用Human ACE2 ELISA Kit(博士德生物)檢測血清ACE2水平。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應，經(jīng)過PBS徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和ACE2水平呈正相關，用 Model 680型酶標儀(Bio-Rad)在450 nm下測定吸光度(A)值。每塊ACE2 ELISA Kit 96孔板均使用ACE2標準品測定標準曲線(R2>0.9)，再根據(jù)A值得到待測血清中ACE2的水平，每個樣本測3個復孔。臨床血清樣本都稀釋2倍，其最后ACE2濃度值大部分在ACE2標準品標準曲線濃度范圍內(nèi)(0～4 000 ng/L)，超過其范圍的重新稀釋后再測定，使其在標準曲線濃度范圍內(nèi)。

3 統(tǒng)計學處理

研究資料通過SPSS 17.0進行統(tǒng)計,計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。在兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。血清ACE2水平與其它指標的相關性釆用Spearman相關分析和二元線性回歸法;多元線性逐步回歸法用于分析對血清ACE2水平有獨立影響的因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多因素logistic回歸分析用于檢測與CHD獨立相關的因素，單因素回歸分析中P<0.05者納入多因素logistic回歸模型。

結 果

1 CHD不同組別樣本的臨床指標分析

輕度狹窄CHD組、中度狹窄CHD組、嚴重狹窄CHD組與對照組(即非CHD組)各組間臨床特征如表1。CHD組(包括上述輕、中、重度狹窄CHD組)年齡明顯比非CHD組大。嚴重狹窄CHD組左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)比非CHD組和輕度狹窄CHD組小(P<0.05)。而白細胞計數(shù)(white blood cell count,WBC)、總膽固醇(total cholesterol, TCHOL)、甘油三酯(triglyceride, TG)、肌酐(creatinine, CREA)、鉀、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、主動脈寬度(width of the aorta,AO)、右室流出道寬度(width of right ventricular outflow tract,RVOT)、左房內(nèi)徑(left atrial diameter,LA)、右室內(nèi)徑(right ventricular diameter，RV)、室間隔厚度 (interventricular septal thickness, IVS)、左室內(nèi)徑(left ventricular diameter, LV)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPW)和肺動脈寬度(pulmonary artery width,PA)水平均無顯著差異。

2 血清ACE2水平在CHD發(fā)生發(fā)展中的變化

輕度狹窄CHD組、中度狹窄CHD組和嚴重狹窄CHD組血清ACE2水平都比非CHD組偏高，并且隨著冠狀動脈狹窄嚴重程度的加深而上升，但只有嚴重狹窄CHD組與非CHD組有顯著差異，見表1。

表1 嚴重程度不同CHD患者臨床指標比較

WBC: white blood cell; TCHOL: total cholesterol; TG: triglyceride; CREA: creatinine; LDH: lactic dehydrogenase; AST: aspartate aminotransferase; AO: width of the aorta; RVOT: width of right ventricular outflow tract; LA: left atrial diameter; IVS: interventricular septal thickness; LV: left ventricular diameter; LVPW: left ventricular posterior wall thickness; PA: pulmonary artery width; LVEF: left ventricular ejection fraction.*P<0.05vsnon-CHD;#P<0.05vsss-CHD.

由于ACE2位于染色體Xp22上，故再按男女性別對以上4組樣本的血清ACE2水平進行分析，結果表明男性血清ACE2水平普遍比女性高(表2)。而且在同一性別內(nèi)，3組CHD樣本的血清ACE2水平都要比非CHD組高而且有顯著差異，嚴重狹窄組與輕度狹窄組、中間狹窄組相比，ACE2水平要高很多并有顯著差異。這結果顯示血清ACE2水平在CHD患者中升高，并且隨病情的加重而升高。

3 血清ACE2水平的其它影響因素

我們還通過Spearman相關分析、二元線性回歸和逐步法多元線性回歸，對其它影響血清ACE2水平的可能因素進行了分析。我們首先將259例樣本按血清ACE2水平的四分位數(shù)分為低水平(小于第1四分位數(shù))、較低水平(第1四分位數(shù)到第2四分位數(shù)之間)、中水平(第2四分位數(shù)到第3四分位數(shù)之間)和高水平(等于或大于第3四分位數(shù))4組。接著，我們將高血壓、糖尿病(diabetes mellitus, DM)、高血脂和表1所列的各臨床指標進行Spearman相關分析和逐步法多元線性回歸分析。Spearman相關分析顯示，血清ACE2水平與CHD患者、DM患者、男性及LA均呈正相關，見表3。

表2 非CHD組、輕度狹窄組、中度狹窄組和嚴重狹窄組按性別區(qū)分的ACE2水平比較

Table 2.Comparison of the ACE2 level among non-CHD, ls-CHD, ms-CHD and ss-CHD groups between males and females (ng/L. Mean±SD)

GroupMaleFemalenon-CHD1248.37±67.99(n=36)786.77±101.81△(n=49)ls-CHD1351.53±104.87**#(n=20)604.13±8.14**#△(n=15)ms-CHD1229.15±89.09#(n=34)1029.26±34.20**#△(n=39)ss-CHD1741.06±149.13**(n=49)1556.47±129.96**△(n=17)

**P<0.01vsnon-CHD;#P<0.05vsss-CHD;△P<0.05vsmale.

表3 血清ACE2水平影響因素的Spearman分析

Table 3.The Spearman analysis of the influence factors for se-rum ACE2 level

IndexrsSEMPCHD0.16982.0530.007DM0.150230.1300.018Sex(male)0.159194.1690.012LA0.22428.1530.023

LA: left atrial diameter.

因LA與CHD關系很密切，所以選擇CHD、糖尿病和性別為自變量，血清ACE2水平為因變量，釆用逐步法進行多元線性回歸。結果顯示性別和CHD為血清ACE2水平的獨立影響因素，見表4。

4 各變量與CHD的logistic回歸分析結果

CHD是血清ACE2水平的獨立影響因素，那血清ACE2水平是否是CHD的獨立影響因素呢？為了進一步探討CHD的影響因素，我們將CHD與其它一系列相關因素進行回歸分析。單因素回歸顯示CHD與血清ACE2水平、吸煙、高血壓、糖尿病、性別、主動脈寬度和室間隔厚度有關(表5)。選擇血清ACE2水平、吸煙、高血壓、糖尿病、性別、主動脈寬度和室間隔厚度進入多元logistic回歸模型，結果顯示沒有變量可作為發(fā)生CHD的獨立預測因素。但是用血清ACE2四分位數(shù)表中較低水平ACE2預測CHD的OR值為3.348 (95%CI 1.469～7.633,P=0.004)。排除CHD、糖尿病、LA和性別這些與血清ACE2水平有相關性的因素后，較低水平ACE2預測CHD的OR值為4.444(95%CI 1.100～17.960，P=0.036)，見表6。

表4 血清ACE2水平獨立影響因素的多元線性回歸分析

Table 4.Multivariate linear regression analysis of the indepen-dent influence factors for serum ACE2 level

IndexRSEMPSex(male)0.049198.6340.027CHD0.13984.1700.031

AdjustedR2is 0.036，P<0.05 for statistical significance.

表5 CHD影響因素二元logistic回歸分析

HBP: high blood pressure; AO: width of the aorta; IVS: interventricular septal thickness.

表6 ACE2水平與CHD的患病風險的關系

afor adjusting for CHD, diabetes, LA and sex as a continuous variable into the equation.

討 論

ACE2是一個極其關鍵的心臟功能調(diào)節(jié)因子。ACE2基因敲除小鼠存在嚴重的心臟功能缺陷，主要表現(xiàn)為左心室變薄、收縮功能下降，揭示ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在心臟的生理過程中發(fā)揮著一定的作用。Ang-(1-7)通過與Mas受體結合而發(fā)揮拮抗Ang Ⅱ、擴張血管、抗纖維化、抗增殖、抑制炎癥、抗凋亡、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡等生物學效應[7]。雖然有許多實驗研究結果顯示，ACE2和其催化產(chǎn)物Ang-(1-7)對心臟和血管具有保護作用，但是它們在心血管系統(tǒng)的生理和病理過程中的重要性尚未研究清楚，血清ACE2水平在冠心病不同病情患者的變化亦缺乏系統(tǒng)研究[5]。本研究結果表明血清ACE2水平在CHD患者中升高，并且隨CHD患者冠狀動脈狹窄嚴重程度的惡化而升高，多元線性逐步回歸法分析發(fā)現(xiàn)性別和CHD是對血清ACE2水平有獨立影響的因素。而多因素logistic回歸分析顯示CHD是較低水平ACE2的危險因素。值得注意的是，CHD是血清ACE2水平的獨立影響因素，可排除其它影響CHD的因素后，ACE2并不是CHD獨立影響因素。這說明CHD在發(fā)生發(fā)展過程中促進了血清中ACE2水平的提高，血清ACE2水平可以作為冠心病預后的一個指標，但不能作為冠心病患病與否的判定指標。

糖尿病、高血壓病和高血脂癥是臨床上常見的疾病，亦是動脈粥樣硬化、CHD以及許多其它血管性疾病發(fā)生的最危險的因素，嚴重威脅人類的健康。Fraga-Silva 等[8]發(fā)現(xiàn)ACE2 通過水解作用產(chǎn)生Ang-(1-7)，Ang-(1-7)與Mas受體結合抑制血栓的形成，在心血管疾病中發(fā)生很大作用。在動物及人的動脈粥樣硬化中，血管的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞上存在ACE2 的mRNA及蛋白質(zhì)的表達。Wang 等[9]表明過表達ACE2可改善內(nèi)皮依賴的血管松弛，增加內(nèi)皮細胞官腔的形成活性及有利于內(nèi)皮細胞的遷移；而ACE2缺陷小鼠的主動脈會引起由乙酰膽堿誘導的內(nèi)皮依賴的血管松弛作用受損。糖尿病患者具有顯著的心血管病好發(fā)傾向,且糖尿病患者合并CHD,冠脈病變常廣泛且嚴重。隨著科學家的深入研究,RAS在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用被大量實驗所證實。ACE2作為RAS重要成員也備受關注。隨后有人發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清ACE2 活性顯著增加[10]。

本文也探討了糖尿病、高血壓和高血脂對患者血清ACE2水平的影響。實驗發(fā)現(xiàn)高血脂癥與CHD、血清ACE2都沒有相關性。高血壓是CHD的影響因素，但不是單獨影響因素，而它和血清ACE2水平?jīng)]有相關性。糖尿病是CHD的影響因素，與血清ACE2水平也有相關性，但它既不是CHD的獨立影響因素，也不是血清ACE2水平的獨立影響因素。而有研究表明激活的RAS系統(tǒng)可以加重糖尿病的代謝紊亂，干擾胰島素信號轉導，減弱胰島素的作用從而加重胰島素抵抗[11];在胰腺，增高的AngII不僅可以減少胰腺的血流灌注[12],還可以通過誘導氧化應激、炎癥反應和纖維化影響胰島細胞的數(shù)量和功能。近來又有人發(fā)現(xiàn)尿液ACE2水平與II型糖尿病相關[13]，這與本文發(fā)現(xiàn)是一致的。

本實驗發(fā)現(xiàn)血清ACE2水平在CHD患者中升高，并且隨病情的惡化而升高，而且CHD是血清ACE2水平的獨立影響因素，說明ACE2在CHD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，具體的作用機制還有待進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Change of ACE2 level in serum during development of coronary heart disease

CHEN Juan1, LIN Yu-bi2, YIN Geng-sheng3, LI Zi-cheng4, CHEN Wan-qun1,HU Juan5, TAN Lin-lin5, XU Shao-ling5, ZHENG Dong-ling5, PAN Yong-quan5

(1DepartmentofBiochemistryandMoleculine,SchoolofBasicMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2GuangdongCardiovascularInstitute,Guangzhou510080,China;3ClinicalLaboratoryCenter，4DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;5FacultyofClinicalMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tchwanq@jnu.edu.cn)

AIM: To analyze the correlation between serum angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) levels and different stages of coronary heart disease (CHD), and to explore the change of serum ACE2 level during the development of CHD. METHODS: The control group included 85 non-CHD samples, and 174 CHD samples were divided into light stenosis (ls-CHD, stenosis degree <50%) group, moderate stenosis (ms-CHD, stenosis degree 50%～75%) group and severe stenosis (ss-CHD, stenosis degree ≥75%) group. The ACE2 level in each serum sample was detected by ELISA. The relationship between the ACE2 level and the development of coronary heart disease was explored by statistical analysis of serum ACE2 levels in different stages of CHD. RESULTS: The serum ACE2 levels in ls-CHD group, ms-CHD group and ss-CHD group were all higher than that in control group. The more severe the coronary artery stenosis existed, the higher the ACE2 level was observed. The serum ACE2 level in the males was higher than that in the females. In a single sex, the serum ACE2 levels in ls-CHD group, ms-CHD group and ss-CHD group were higher than that in control group with significant differences. Regression analysis found that sex, diabetes and CHD were associated with the serum ACE2 levels. Among them, sex and CHD were the independent factors to affect serum ACE2 levels. CONCLUSION: The serum ACE2 level of males was higher than that of females. Compared with the non-CHD samples, the serum ACE2 level of CHD patients was higher than that of the non-CHD samples. During the development of coronary heart disease, the serum ACE2 level increased constantly.

Serum; Angiotensin-converting enzyme 2; Coronary heart disease

1000- 4718(2017)06- 1086- 05

2017- 01- 05

2017- 04- 26

廣東省科技計劃項目(No.2013B022000074)

R541.4； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.021

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△通訊作者 Tel： 020-85220256； E-mail: tchwanq@jnu.edu.cn