劉紅霞， 潘 虹， 王 華， 蔣淑君， 曹 璋， 辛文妤

(濱州醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2病理學(xué)教研室， 3藥理學(xué)教研室， 山東 煙臺(tái) 264003)

杏仁核腦區(qū)硫化氫對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠抑郁樣行為的影響*

劉紅霞1△， 潘 虹1， 王 華1， 蔣淑君1， 曹 璋2， 辛文妤3

(濱州醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2病理學(xué)教研室，3藥理學(xué)教研室， 山東 煙臺(tái) 264003)

目的： 探討創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)大鼠抑郁樣行為改變及杏仁核內(nèi)胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/硫化氫(hydrogen sulfide,H2S) 水平的變化，并研究補(bǔ)充H2S對(duì)大鼠抑郁樣行為的作用及機(jī)制。方法: 應(yīng)用連續(xù)單一應(yīng)激方案制備PTSD動(dòng)物模型，用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測大鼠抑郁樣行為，用Western blot技術(shù)和亞甲基藍(lán)法檢測杏仁核CBS/H2S 體系含量，用整體細(xì)胞外電生理方法記錄杏仁核神經(jīng)元放電情況。結(jié)果: 與正常對(duì)照組比較，PTSD組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(P<0.01)，糖水偏好率顯著降低(P<0.01)；杏仁核腦區(qū)的CBS/H2S 體系含量顯著降低(P<0.01)。與PTSD組比較，PTSD+硫氫化鈉組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.01)，糖水偏好率顯著升高(P<0.01)。微量壓力注射L-半胱氨酸使杏仁核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率顯著升高(P<0.01)。結(jié)論: PTSD大鼠通過抑制杏仁核CBS/H2S 體系導(dǎo)致抑郁樣行為加重。H2S拮抗PTSD大鼠抑郁樣行為的機(jī)制可能與其增加杏仁核神經(jīng)元放電頻率和興奮性有關(guān)。

硫化氫； 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙； 胱硫醚β-合成酶； 杏仁核

暴力事件、自然災(zāi)害和重大交通事故等意外事件可導(dǎo)致親身經(jīng)歷者和目擊者罹患創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)，防治本病已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題。PTSD發(fā)病機(jī)制多樣，杏仁核可能是影響PTSD癥狀的關(guān)鍵核團(tuán)，在條件性恐懼的獲得、表達(dá)和消退中具有關(guān)鍵作用[1]；人類腦成像研究表明PTSD患者杏仁核活動(dòng)增強(qiáng)[2]，可能是PTSD患者條件性恐懼不易消退的原因；海馬-杏仁核特別是杏仁核基底外側(cè)核(basolate-ral amygdala，BLA)神經(jīng)環(huán)路突觸效能的長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)可能是條件性恐懼和應(yīng)激所致焦慮的神經(jīng)基礎(chǔ)[3]。目前沒有特效藥治療該病，主要有抗抑郁藥和心理治療，因此探究PTSD的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尋找治療靶點(diǎn)具有重要意義。腦內(nèi)硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)有多種神經(jīng)調(diào)控功能，可參與學(xué)習(xí)記憶和情緒調(diào)節(jié)。H2S選擇性上調(diào)含NR2B亞基的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受體功能，參與杏仁核介導(dǎo)的條件恐懼情感記憶行為；外源性H2S增強(qiáng)杏仁核依賴的情感記憶，減緩記憶的遺忘[4]。而PTSD患者的臨床癥狀中就有條件性恐懼行為和學(xué)習(xí)記憶能力下降。那么硫化氫是否影響PTSD患者的抑郁樣行為？其機(jī)制如何？我們應(yīng)用連續(xù)單一應(yīng)激方案制備PTSD大鼠模型，用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測大鼠抑郁樣行為，用Western blot技術(shù)和亞甲基藍(lán)法檢測杏仁核的胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)/H2S體系含量，用整體細(xì)胞外電生理方法記錄杏仁核神經(jīng)元放電情況，對(duì)以上問題進(jìn)行研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥

成年健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～300 g，青島市藥檢所動(dòng)物中心提供，大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周。造模后第14天檢測行為學(xué)指標(biāo)。治療組于造模前0.5 h及行為學(xué)測試前0.5 h分別腹腔注射11.2 mg/kg 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)。正常對(duì)照組(normal組)和PTSD組腹腔注射等劑量生理鹽水。

2 主要藥品和儀器

CBS抗體購自Santa Cruz; NaHS和滂胺天藍(lán)購自Sigma; Micro1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Spike2數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)購自CED。

3 主要方法

3.1 制備PTSD模型 采用連續(xù)單一應(yīng)激(single prolonged stress，SPS)方案制備大鼠PTSD模型，將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述處理：禁錮2 h；強(qiáng)迫性游泳20 min(水溫25 ℃，水深40 cm)；休息15 min后乙醚麻醉，意識(shí)喪失后停止麻醉。

3.2 大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將單只大鼠置于游泳圓筒內(nèi)(筒高70 cm, 內(nèi)徑30 cm, 水面高度35 cm, 水溫23～25 ℃)，游泳6 min，前2 min作為大鼠適應(yīng)階段，后4 min記錄不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間。每只大鼠更換1次游泳用水，避免重復(fù)用水對(duì)測試大鼠產(chǎn)生影響。用漂浮不動(dòng)時(shí)間作為判斷大鼠抑郁嚴(yán)重程度的指標(biāo)，不動(dòng)時(shí)間越長，表示大鼠絕望狀態(tài)越嚴(yán)重，抑郁樣行為越嚴(yán)重。

3.3 大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn) 訓(xùn)練期間，大鼠單籠飼養(yǎng)，每籠配備2瓶水，1瓶飲用水，1瓶1%蔗糖水溶液，適應(yīng)該狀態(tài)48 h，每12 h對(duì)調(diào)2個(gè)水瓶位置，用以消除大鼠的飲水位置偏好。測試前禁食禁水12 h開始，將飲用水、1%蔗糖水溶液放回原位，讓大鼠自由飲水1 h，分別計(jì)算出各水瓶消耗量。計(jì)算糖水偏好率(%)：蔗糖水飲用體積/總飲用體積×100%。糖水偏好率值越低，表示大鼠快感缺失，具有抑郁傾向。

3.4 硫化氫含量檢測 腦組織的H2S含量用亞甲藍(lán)法進(jìn)行檢測[5]。大鼠麻醉后斷頭，冰上取雙側(cè)杏仁核，稱重-80 ℃冰箱備用。在冷的磷酸氫鉀緩沖液(pH 7.4)中將腦組織勻漿裂解(每mg組織加10 μL 緩沖液)。200 μL 組織裂解上清與1% 醋酸鋅生成硫化鋅沉淀，20 000×g離心力離心15 min，將沉淀用溶于7.2 mol/L鹽酸的N,N-二甲基對(duì)苯二胺硫酸鹽(20 mmol/L)150 μL 和溶于1.2 mol/L鹽酸的FeCl3(30 mmol/L)100 μL 液體進(jìn)行溶解。靜置15 min，將200 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中用670 nm 波長行吸光度檢測。配制NaHS濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度(A)值，計(jì)算樣品H2S含量。為防止H2S與玻璃結(jié)合，整個(gè)實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯塑料管為容器。

3.5 Western blot方法檢測腦組織CBS蛋白的表達(dá) 大鼠麻醉后斷頭，冰上取出雙側(cè)杏仁核，稱重后-80 ℃冰箱備用。提取組織總蛋白并BCA法行蛋白定量，加入上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min，凍存于-80 ℃冰箱備用。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，各泳道加入的樣品蛋白總量為40 μg。電泳將蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。TBST配制的5%脫脂奶粉室溫振搖1 h，加 I 抗 (CBS多克隆抗體，1∶2 000)4 ℃過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000)室溫2 h，并分別洗滌，ECL顯色后暗室中壓片、顯影、定影，掃描后用 ImageJ軟件分析各條帶的灰度值。

3.6 電生理學(xué)方法 體質(zhì)量200～300 g的健康雄性Wistar大鼠，腹腔注射20%烏來糖(1 g/kg)進(jìn)行麻醉。大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦圖譜(Paxinos & Watson， 2005)定位，BLA區(qū)坐標(biāo)如下：前囟向后2.8 mm，中線旁開4.5 mm，向下7.5～9.0 mm。液壓推進(jìn)器將三管玻璃微電極送至杏仁核，觀察細(xì)胞放電平穩(wěn)5 min，用PM2000B型四道壓力注射儀通過氣體壓力(1 500 ms, 5.0～15.0 psi)將藥物注射到神經(jīng)元表面，用Spike2數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞放電頻率進(jìn)行分析，通過Micro1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)顯示細(xì)胞放電曲線。將加藥后反應(yīng)高峰50 s內(nèi)平均每秒放電頻率作為藥物的效應(yīng)，以加藥前120 s內(nèi)平均每秒放電頻率為對(duì)照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。作圖采用SigmaPlot 10.0。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(兩兩比較行Bonferroni校正的t檢驗(yàn))分析不同組間的差別，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SPS方案制備PTSD動(dòng)物模型后，大鼠抑郁樣行為加重，杏仁核CBS/H2S體系生成減少

采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測大鼠抑郁行為，結(jié)果如圖1所示，與正常對(duì)照組比較，PTSD組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(P<0.01)。

Figure 1.The immobility time of forced swimming test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖1 造模前后大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間的比較

采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測大鼠抑郁行為，結(jié)果如圖2所示，與正常對(duì)照組比較，PTSD組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.01)。

如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，PTSD大鼠杏仁核腦區(qū)的H2S含量顯著降低(P<0.01)。

如圖4所示，PTSD大鼠海馬腦區(qū)CBS的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。

2 H2S供體NaHS可改善PTSD大鼠抑郁樣行為

與PTSD組比較，PTSD+NaHS組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.01)，見圖5A。與PTSD組比較，PTSD+NaHS組大鼠糖水偏好率顯著增加(P<0.01)，見圖5B。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示H2S改善PTSD大鼠抑郁樣行為。

Figure 2.The sucrose preference in sucrose preference test in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖2 造模前后大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水偏好率的比較

Figure 3.The H2S level in the amygdala tissues of normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group.

圖3 造模前后大鼠杏仁核組織內(nèi)源性H2S含量比較

Figure 4.The CBS level in the amygdala tissues in normal group and PTSD group. Mean±SEM.n=4.##P<0.01vsnormal group.

圖4 造模前后大鼠杏仁核組織CBS含量的比較

Figure 5.The immobility time in forced swimming test (A) and the sucrose preference in sucrose preference test (B) in different groups. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsnormal group；**P<0.01vsPTSD group.

圖5 各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水偏好率的比較

3 H2S供體L-cysteine對(duì)正常大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞外放電的影響

用多管微電極細(xì)胞外電生理記錄方法觀察L-cysteine對(duì)大鼠整體狀態(tài)下杏仁核神經(jīng)元放電頻率的影響，結(jié)果如圖6所示。微量壓力注射無菌生理鹽水前后杏仁核神經(jīng)元的放電頻率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；注射L-cysteine后杏仁核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率顯著升高(P<0.01)。

Figure 6.The effects of H2S system on the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. A: initial graph of the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons; B: the quantitative analysis of saline on firing rate； C: the quantitative analysis of L-cysteine on firing rate. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsbefore.

圖6 L-cysteine對(duì)正常大鼠杏仁核神經(jīng)元放電頻率的影響

討 論

PTSD是個(gè)體經(jīng)歷威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷后，精神癥狀延遲出現(xiàn)和長期存在的精神障礙，患者有強(qiáng)烈的恐懼和驚嚇反應(yīng)。本研究選取的SPS動(dòng)物模型是PTSD行為敏感化常用的應(yīng)激模式，能夠模仿人類嚴(yán)重創(chuàng)傷事件后長期的生理改變和行為改變等關(guān)鍵特征，主要模擬了PTSD患者對(duì)創(chuàng)傷線索的驚嚇反應(yīng)增強(qiáng)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)可作為動(dòng)物抑郁程度的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究采用SPS方案制備PTSD動(dòng)物模型，采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間和糖水偏好實(shí)驗(yàn)來檢測大鼠抑郁樣行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，PTSD組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間顯著延長，糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水偏好率顯著降低，提示PTSD模型大鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為，這與陳云春等[6]研究結(jié)果一致，提示SPS方案制備的PTSD動(dòng)物模型可成功模仿人類的抑郁狀態(tài)。

杏仁核的主要功能是產(chǎn)生與外界信息相適應(yīng)的情緒行為，調(diào)控情緒學(xué)習(xí)和記憶[7]。其中杏仁核基底外側(cè)復(fù)核和中央核被認(rèn)為是恐懼學(xué)習(xí)和記憶中重要的中樞。杏仁核功能失調(diào)可導(dǎo)致患者或動(dòng)物出現(xiàn)異常的情感行為和情感功能障礙[8]。PTSD患者和動(dòng)物的研究表明杏仁核、海馬與內(nèi)側(cè)前額葉皮層在PTSD相關(guān)癥狀中具有重要作用；杏仁核可能是影響PTSD癥狀的關(guān)鍵核團(tuán)，在條件性恐懼的獲得、表達(dá)和消退中具有關(guān)鍵作用[1]；人類腦成像研究表明PTSD患者的杏仁核活動(dòng)增強(qiáng)[2]，這可能是PTSD患者條件性恐懼不易消退的原因。故我們研究了PTSD模型大鼠與杏仁核相關(guān)的行為學(xué)變化和機(jī)制。

氣體信號(hào)分子H2S在腦內(nèi)含量較高(50～160 μmol/L)，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[9]，硫化氫參與學(xué)習(xí)記憶和情緒調(diào)節(jié)。研究證實(shí)H2S選擇性上調(diào)含NR2B亞基的NMDA受體的功能進(jìn)而調(diào)節(jié)杏仁核介導(dǎo)的條件恐懼情感記憶行為，外源性H2S可增強(qiáng)杏仁核依賴的情感記憶，并減緩記憶的遺忘[4]。CBS是大腦合成H2S的關(guān)鍵酶，免疫組化結(jié)果顯示杏仁核表達(dá)大量的CBS，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞[10]。杏仁核內(nèi)注射CBS抑制劑可損傷大鼠線索型恐懼記憶，表明膠質(zhì)細(xì)胞源性H2S是杏仁核相關(guān)情感記憶所必需的。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTSD大鼠杏仁核腦區(qū)CBS的表達(dá)和H2S的生成均顯著低于正常對(duì)照組，提示杏仁核腦區(qū)CBS/H2S體系受抑制可能與PTSD患者的抑郁樣行為相關(guān)。侯曉怡[11]報(bào)道了外源性補(bǔ)充H2S對(duì)急、慢性應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠抑郁樣行為均有改善作用。NaHS是較常用H2S供體，腹腔注射NaHS可以促進(jìn)腦內(nèi)H2S水平的升高[5]。故本研究通過腹腔注射NaHS研究H2S對(duì)PTSD大鼠抑郁樣行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NaHS治療明顯改善了PTSD大鼠的抑郁樣行為。這些結(jié)果均提示調(diào)控腦內(nèi)H2S含量可能是治療不同病因誘發(fā)抑郁癥的新策略。

杏仁核區(qū)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid, AMPA)受體和NMDA受體等興奮性谷氨酸受體在情感學(xué)習(xí)和記憶形成過程中扮演著重要角色[12]；H2S可抑制興奮性氨基酸的釋放，易化海馬LTP[13]；電生理研究也證實(shí)了H2S選擇性上調(diào)含NR2B亞基的NMDA受體的功能進(jìn)而參與杏仁核介導(dǎo)的條件恐懼情感記憶行為，外源性H2S可增強(qiáng)杏仁核依賴的情感記憶，并減緩記憶的遺忘[4]。以上研究均提示硫化氫可以影響神經(jīng)元的電生理特性。故本實(shí)驗(yàn)利用在體細(xì)胞外電生理記錄法，觀察H2S供體L-cysteine對(duì)大鼠杏仁核神經(jīng)元電生理特性的影響。與以上文獻(xiàn)[4, 9]報(bào)道一致，L-cysteine可以影響神經(jīng)元的電生理特性，主要表現(xiàn)為L-cysteine對(duì)杏仁核神經(jīng)元產(chǎn)生興奮效應(yīng)，使杏仁核神經(jīng)元放電頻率升高。綜合文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們分析，增加杏仁核神經(jīng)元放電頻率和興奮性可能是H2S改善PTSD大鼠抑郁樣行為的機(jī)制之一。

綜上所述，PTSD大鼠通過抑制杏仁核腦區(qū)CBS/H2S 體系導(dǎo)致抑郁樣行為加重，H2S可拮抗PTSD大鼠抑郁樣行為，該作用可能與其增加杏仁核神經(jīng)元放電頻率和興奮性有關(guān)。該研究可為臨床尋找防治創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙靶點(diǎn)提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of amygdala H2S system on depression-like behavior in posttraumatic stress disorder rats

LIU Hong-xia1, PAN Hong1, WANG Hua1, JIANG Shun-jun1, CAO Zhang2, XIN Wen-yu3

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2DepartmentofPathology,3DepartmentofPharmacology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China.E-mail:liuhongxia3210@163.com)

AIM: To explore the depression-like behavior and cystathionine β-synthase (CBS)/hydrogen sulfide (H2S) levels of amygdala in posttraumatic stress disorder (PTSD) rats and to study the effect of exogenous H2S on PTSD rats.METHODS: Single prolonged stress paradigm was adopted to prepare PTSD animal model. Forced swimming test and sucrose preference test were used to evaluate the depression-like behavior. The content of CBS/H2S in amygdala tissue was measured by Western blot and methylene blue method.Invivoextracellular single unit recordings was used to examine the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons. RESULTS: The immobility time in forced swimming test of PTSD group increased and sucrose preference in sucrose preference test of PTSD group decreased compare with normal group (P<0.01). CBS/H2S level in amygdala tissue of PTSD group decreased compared with normal group (P<0.01). The immobility time of the rats in forced swimming test of NaHS+PTSD group decreased and the sucrose prefe-rence in sucrose preference test of NaHS+PTSD group increased compare with PTSD group (P<0.01). L-cysteine increased the frequency of spontaneous discharges of amygdala neurons (P<0.01). CONCLUSION: Depression-like behavior is aggravated in PTSD model rats owing to the inhibition of CBS/H2S content in amygdala tissue. The mechanism of behavior-improving effect of H2S on PTSD model rats is possibly related to excitating amygdala neurons and increasing the frequency of spontaneous discharges.

Hydrogen sulfide; Posttraumatic stress disorder; Cystathionine β-synthase; Amygdala

1000- 4718(2017)06- 0988- 05

2016- 10- 19

2017- 03- 20

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2013HL009； No.BS2015YY036； No.BS2014YY049)；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012ZH248； No.2015ZH085)

R749.5+; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.005

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