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        Sonic hedgehog信號通路與食管癌放射抗拒的相關性研究*

        2017-06-24 12:25:49賀昱霖劉佳琪孟忠吉吳清明
        中國病理生理雜志 2017年6期
        關鍵詞:細胞系鱗癌食管癌

        賀昱霖, 劉佳琪, 劉 群, 李 歡, 龍 輝, 孟忠吉, 吳清明△

        (武漢科技大學 1醫(yī)學院, 2附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科, 湖北 武漢 430065;3十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學研究所, 湖北 十堰 442000)

        Sonic hedgehog信號通路與食管癌放射抗拒的相關性研究*

        賀昱霖1,3, 劉佳琪1, 劉 群2, 李 歡2, 龍 輝2, 孟忠吉3, 吳清明1△

        (武漢科技大學1醫(yī)學院,2附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科, 湖北 武漢 430065;3十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學研究所, 湖北 十堰 442000)

        目的: 研究Sonic hedgehog (Shh)信號通路在食管癌放射抗拒中的作用及機制。方法: 以人食管癌細胞Eca109為親本株,通過X射線反復照射(累計照射劑量60 Gy)誘導形成放射抗拒細胞株Eca109R。分別采用集落形成實驗檢測細胞放射敏感性,CCK-8實驗檢測細胞活力的變化,來證實放射抗拒細胞株Eca109R的放射抗拒性。免疫熒光及Western blot檢測Eca109R和親本細胞Eca109內(nèi)Gli1蛋白與Shh蛋白的表達。結果: 集落形成實驗顯示2 Gy的X線照射后,Eca109和Eca109R細胞的存活分數(shù)(SF2)分別為0.499±0.042和0.937±0.013;同時,CCK-8實驗顯示,Eca109R細胞的活力抑制率明顯低于Eca109細胞(P<0.05),證實Eca109R細胞有明顯的放射抗拒性,誘導形成放射抗拒株成功。免疫熒光結果顯示Eca109R細胞中Gli1表達明顯高于Eca109細胞(P<0.05)。Western blot實驗結果顯示Eca109R細胞中的Gli1與Shh蛋白表達明顯高于Eca109細胞(P<0.05)。結論: 食管癌放射抗拒性的產(chǎn)生可能與Shh信號通路相關蛋白的過表達有關。

        食管癌; 放射抗拒性; Sonic hedgehog信號通路

        食管癌(esophageal cancer)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第8位,死亡率位于第6位[1-2],放射治療是最有效的治療手段之一,但放射治療可能引起腫瘤對放療產(chǎn)生抗拒性。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),Sonic hedgehog (Shh)信號通路與消化道腫瘤的發(fā)生密切相關[3-4],Gli1是Shh信號通路下游的轉錄因子,Gli1表達水平的上調代表Shh信號通路的激活,食管鱗癌中存在Shh信號通路相關基因的高表達[5-6]。本實驗通過反復照射食管癌細胞系Eca109,建立食管癌放射抗拒細胞系,并檢測細胞中Gli1與Shh蛋白的表達,探究Shh信號通路與食管癌放射抗拒性之間的關系,為臨床提高食管癌放療療效提供新的方案和依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 細胞株、主要試劑與儀器

        人食管癌細胞株Eca109(由十堰太和醫(yī)院李勝保博士惠贈);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品);CCK-8試劑盒(Sigma);抗Gli1抗體和抗Shh抗體(北京博奧森公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱和超凈工作臺(Thermo Fisher)。

        2 方法

        2.1 細胞培養(yǎng) Eca109細胞系于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

        2.2 細胞照射 采用Varian 2300直線加速器6 MV X射線照射,照射野6 cm×4 cm,源靶距80 cm,培養(yǎng)瓶表面覆蓋1.5 cm厚的補償塊,吸收劑量率為2 Gy/min。取指數(shù)生長期Eca109細胞1瓶,用直線加速器照射2 Gy、1 min。之后繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待照射后細胞穩(wěn)定生長并增長至接近長滿瓶底時,用0.25%胰蛋白酶(含0.25%EDTA)消化細胞,重新接種培養(yǎng),待細胞增殖進入指數(shù)生長期時,再次X射線照射2 Gy、1 min。重復以上過程,照射30次,共60 Gy。然后傳代培養(yǎng)至細胞形態(tài)、增殖狀態(tài)穩(wěn)定,即篩選得到放射抗拒細胞系,將該放射抗拒細胞命名為Eca109R。繼續(xù)培養(yǎng)14 d后取部分細胞凍存,部分繼續(xù)傳代培養(yǎng),在不再照射的情況下常規(guī)傳代>50代,仍保持較高的放射抗拒性。

        2.3 細胞形態(tài)學觀察 光學顯微鏡下觀察細胞單層貼壁后指數(shù)生長期的細胞形態(tài)學差異。

        2.4 集落形成實驗檢測細胞放射敏感性 將指數(shù)生長期Eca109細胞和Eca109R細胞消化計數(shù)后制備成單細胞懸液,根據(jù)不同細胞數(shù)目(4×102、4×102、8×102、1×103和1.2×103)接種于6孔板,貼壁12 h后,進行細胞照射,照射劑量分別為0、2、4、6和8 Gy,繼續(xù)培養(yǎng)14 d,出現(xiàn)肉眼可見的集落。用甲醇固定,結晶紫染色,計數(shù)集落數(shù)(>50個細胞的集落)。用單擊多靶模型計算細胞放射敏感性參數(shù),包括平均致死劑量(mean lethal dose,D0)、準閾劑量(quasi-threshold dose,Dq)、外推值(extrapolation value,N)以及照射2 Gy后細胞存活分數(shù)(survival fraction at 2 Gy,SF2),實驗重復3次。

        2.5 CCK-8實驗檢測細胞活力 取經(jīng)過2、4、6和8 Gy劑量照射對數(shù)期生長的Eca109和Eca109R細胞,分別將其制成單細胞懸液后并計數(shù),接種于96孔板,每孔約5 000個細胞,放置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后加入10 μL CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,在酶標儀450 nm波長下測各孔吸光度(A)值,根據(jù)各組細胞在450 nm下的A值,用公式計算細胞活力抑制率,抑制率(IR)=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%,實驗重復3次。

        2.6 免疫熒光檢測Gli1蛋白的表達 制備Eca109和Eca109R細胞爬片,甲醇固定15 min,山羊血清封閉10 min,加Gil1抗體(1∶100),37 ℃孵育1 h,PBS洗3次,加 II 抗,避光孵育1.5 h,PBS 洗3次,每次10 min,DAPI復染10 min,封片,熒光顯微鏡鏡檢照相。

        2.7 Western blot檢測Gli1和Shh蛋白的表達 用RIPA裂解液分別提取Eca109細胞和Eca109R細胞的總蛋白,用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度,煮沸變性,每孔加樣35 μg蛋白,采用SDS-PAGE(2 h)分離蛋白,之后轉膜2 h,5%脫脂奶粉封閉2 h,I 抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,II 抗室溫下孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL化學發(fā)光法檢測蛋白的表達,對圖像進行灰度分析,實驗重復3次。

        3 統(tǒng)計學處理

        采用SPSS 14.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結 果

        1 Eca109細胞和Eca109R細胞形態(tài)學

        相差顯微鏡下可見2種細胞呈單層貼壁生長,高倍鏡下見Eca109R細胞呈不規(guī)則梭型,細胞核小,細胞質顆粒密集;Eca109細胞呈圓形或不規(guī)則多邊形,細胞核中染色體折光性強,見圖1。

        2 Eca109細胞和Eca109R細胞放射敏感性

        Eca109細胞與Eca109R細胞照射2、4、6和8 Gy劑量后,用單擊多靶模型擬合,Eca109與Eca109R細胞存活分數(shù)見圖2。2組細胞對應劑量的細胞存活分數(shù)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),可見Eca109R細胞有明顯的放射抗拒性。相關放射生物學參數(shù)見表1,Eca109R細胞D0、Dq和N值均高于Eca109細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        Figure 1.Observation of cell morphology (optical microscope, ×400).

        圖1 細胞形態(tài)學觀察

        Figure 2.The survival fractions of the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

        圖2 Eca109與Eca109R細胞存活分數(shù)的比較

        3 Eca109細胞和Eca109R細胞活力的變化

        經(jīng)過不同劑量照射后,Eca109R細胞各個劑量的活力抑制率均明顯低于Eca109細胞對應劑量,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

        4 Eca109R細胞高表達Shh和Gli1蛋白

        Gli1蛋白的相對分子質量是118 kD,Shh蛋白的相對分子質量是50 kD,內(nèi)參照蛋白β-actin的相對分子質量是42 kD。結果顯示,Eca109細胞和Eca109R細胞中均有Gli1蛋白和Shh蛋白的表達,但Eca109R細胞中Gli1蛋白和Shh蛋白的表達明顯高于Eca109細胞,見圖4。

        5 Eca109R中Gli1蛋白向細胞核聚集

        Eca109和Eca109R 細胞胞核及胞漿均有Gli1蛋白表達,Eca109R中大部分細胞的胞漿Gli1蛋白向細胞核聚集。Eca109與Eca109R 細胞的免疫熒光陽性細胞率分別為52.3%±0.035%和87.6%±0.021%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5。

        表1 X射線照射對Eca109與Eca109R細胞放射生物學參數(shù)的影響

        N: extrapolation value; D0: mean lethal dose; Dq: quasi-threshold dose; SF2: survival fraction at 2 Gy.

        Figure 3.The inhibitory rate of the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

        圖3 細胞活力抑制率的比較

        討 論

        我國屬于食管癌高發(fā)地區(qū),放射治療是最有效的治療手段之一,但不同患者對放療的敏感性不同,療效差異大,究其原因,除了與腫瘤靶區(qū)勾畫、劑量要求不一等因素有關外,腫瘤細胞自身對放射線就存在一定的抗拒性,也成為導致放療療效有限甚至失敗的重要原因。目前,對于腫瘤細胞放射抗拒機制的研究已經(jīng)有很多,涉及了多種復雜的因素,如細胞周期紊亂、DNA的損傷、修復,放射所致細胞信號轉導通路改變、血管形成、細胞微環(huán)境、細胞的凋亡、分化等[7]。Shh信號轉導通路由Shh配體、2個跨膜蛋白質受體Ptch和Smo組成的受體復合物以及下游的轉錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2和Gli3)等組成。在沒有Shh配體信號刺激時,Ptch抑制Smo的活性。當Shh與Ptch結合后,解除了Ptch對Smo的抑制,釋放的Smo進入細胞內(nèi),引發(fā)細胞內(nèi)信號下傳,激活下游轉錄因子Gli家族,調節(jié)包括Wnt、Ptc、cyclin D1、N-Myc在內(nèi)的多種靶基因的表達,從而導致與細胞增殖、凋亡等相關的事件發(fā)生[8]。Gli1是Shh下游靶基因的強激活子,被認為是Shh信號通路的可信標志。Shh信號通常在成人正常組織中不表達,僅在參與組織的修復時激活。成人Shh信號通路過度激活可導致細胞過度增殖、抑制細胞凋亡,最終導致腫瘤的發(fā)生。近年來已有多項研究表明,Shh信號通路的異常激活與多種腫瘤形成有關,如神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、小細胞肺癌和結腸癌等[9-12],而且在對浸潤性乳腺癌患者進行研究后發(fā)現(xiàn)癌組織中Shh、Ptch-1、Gli1和Smo的mRNA呈高表達的患者腫瘤復發(fā)率高[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn),人食管鱗癌組織中Shh的陽性表達明顯高于癌旁組織,且Shh蛋白的表達與食管鱗癌患者的TNM分期有關[14]。因此,進一步研究Shh信號通路與食管癌的關系具有重要意義。

        Figure 4.The protein expression of Shh and Gli1 in the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsEca109.

        圖4 Eca109細胞與Eca109R細胞中Shh與Gli1蛋白表達水平的比較

        Figure 5.Observation of the Gli1 immunofluorescence staining (fluorescence microscope, ×400).

        圖5 Gli1的免疫熒光染色

        本實驗利用X射線反復照射人食管癌細胞系Eca109,誘導出放射抗拒細胞系Eca109R,應用單擊多靶模型進行計算后,得出的放射生物學參數(shù)顯示Eca109R細胞的N 值、D0及Dq均增大,提示抗拒株Eca109R細胞比親本株Eca109細胞更具放射抗性,同時,細胞活力抑制率提示Eca109R細胞的活力明顯高于Eca109,證實了Eca109R細胞放射抗性的產(chǎn)生。Western blot結果顯示Gli1蛋白與Shh蛋白在Eca109R細胞中的表達明顯高于Eca109細胞,而免疫熒光結果顯示Eca109R細胞內(nèi)Gli1蛋白呈現(xiàn)與親本細胞顯著異常的表達水平和模式。已經(jīng)有研究表明,Shh信號通路的激活與食管鱗癌的發(fā)展有關,食管鱗癌中存在Shh信號通路相關基因的高表達,而高表達Gli1的食管鱗癌患者對放射治療不敏感[6, 15],這與我們的研究結果是一致的,因此,Shh信號通路的激活可能與食管鱗癌的放射抗拒性有關。Shh蛋白表達與Gli1蛋白表達一致,說明可能由于Shh信號通路上游的配體過表達,引起Gli1蛋白表達上調,從而影響腫瘤細胞的增殖。

        食管癌放射抗拒性形成的機理相當復雜,有待進一步深究。通過本實驗,建立了食管癌放射抗拒細胞系,證實了引起食管癌放射抗拒的重要原因之一是Shh信號通路的過度激活,為進一步研究Shh信號通路的激活誘導放射抗拒的機制提供了新的實驗基礎,Shh信號通路的其它相關分子如Ptch-1、Smo等在Eca109R細胞的表達情況有待于進一步完善。

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        (責任編輯: 盧 萍, 羅 森)

        Relationship between Sonic hedgehog signaling pathways and radioresistance of esophageal cancer

        HE Yu-lin1, 3, LIU Jia-qi1, LIU Qun2, LI Huan2, LONG Hui2, MENG Zhong-ji3, WU Qing-ming1

        (1SchoolofMedicine,2DepartmentofGastroenterology,AffiliatedTianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China;3InstituteofBiomedicine,TaiheHospitalofShiyanCity,Shiyan442000,China.E-mail:wuhe9224@sina.com)

        AIM: To investigate the potential role of Sonic hedgehog (Shh) signaling pathways in the radioresistance of esophageal cancer. METHODS: Radioresistant cell line Eca109R was established by repeating X-ray irradiation at dose of 60 Gy in total using Eca109 cells as parental cells. The radiosensitivity of the parental and radioresistant cells was confirmed by colony formation assay. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The intracellular protein levels of Shh and Gli1 were determined by Western blot and immunofluorescence.RESULTS: The survival fractions at dose of 2 Gy for Eca109R cells and Eca109 cells were 0.937±0.013 and 0.499±0.042, respectively. The inhibitory rate of cell viability decreased gradually in the Eca109R cells (P<0.05), suggesting that the radioresistant cell line was successfully established. The results of Western blot indicated that the protein expression of Shh and Gli1 was much higher in the Eca109R cells than that in the Eca109 cells (P<0.05). Immunofluorescence staining showed that Gli1 was expressed in the cytoplasm and nucleus, and presented nuclear clustering in the Eca109R cells. The positive rate of Gil1 expression in Eca109 cells was 52.3%± 0.035%, while that in Eca109R cells was 87.6%±0.021% (P<0.05).CONCLUSION: The radioresistance of esophageal cancer may be related to the activation of Shh signaling pathways with over-expression of Gli1 and other related proteins.

        Esophageal cancer; Radioresistance; Sonic hedgehog signaling pathways

        1000- 4718(2017)06- 1043- 05

        2016- 11- 30

        2017- 02- 10

        湖北省自然科學基金資助項目(No. 2014CFB818);湖北省醫(yī)學領軍人才工程補助

        R735.1; R730.23

        A

        10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.014

        雜志網(wǎng)址: http://www.cjpp.net

        △通訊作者 Tel: 027-68893438; E-mail: wuhe9224@sina.com

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