張溫花, 張文超, 于遠(yuǎn)東

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科, 山東 濟(jì)南 250012; 2德州市人民醫(yī)院泌尿外科, 山東 德州 253014； 3河南省直第三人民醫(yī)院泌尿外科, 河南 鄭州 450006)

淫羊藿苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞株活力、遷移與侵襲的作用*

張溫花1, 張文超2▲, 于遠(yuǎn)東3△

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科, 山東 濟(jì)南 250012;2德州市人民醫(yī)院泌尿外科, 山東 德州 253014；3河南省直第三人民醫(yī)院泌尿外科, 河南 鄭州 450006)

目的： 探討淫羊藿苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞株Du145與PC3的存活、遷移與侵襲能力的影響，并初步研究其機(jī)制。方法：CCK-8法檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷(0、5、10、20、40和80 μmol/L)對(duì)Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞活力的影響；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；Western blot檢測(cè)Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白水平。結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示淫羊藿苷呈濃度依賴性抑制Du145與PC3細(xì)胞的活力，當(dāng)濃度到達(dá)40 μmol/L時(shí)，抑制作用達(dá)到最大；經(jīng)淫羊藿苷干預(yù)后，Du145和PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降，Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表達(dá)水平顯著下降。結(jié)論：淫羊藿苷具有抑制前列腺癌細(xì)胞株Du145與PC3生長(zhǎng)、遷移和侵襲的作用，其作用機(jī)制可能與淫羊藿苷抑制Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

淫羊藿苷； 前列腺癌細(xì)胞； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞侵襲

前列腺癌是男性常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在歐美國(guó)家高居第一位，死亡率位于第二位[1]，我國(guó)的發(fā)病率雖低于發(fā)達(dá)國(guó)家，但隨著生活水平日益提高與環(huán)境變化，發(fā)病率逐年升高[2]。目前，前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未清晰。多數(shù)患者在就診時(shí)，已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)。為了更有效地治療前列腺癌，學(xué)者們不停致力于研究其發(fā)生的分子機(jī)制，以期實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期診斷與治療。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明淫羊藿苷(icariin，ICA)是小檗科重要植物淫羊藿的主要活性成分，具有抗衰老、提高免疫力與抑制腫瘤等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠拮抗雷公藤多苷導(dǎo)致的睪丸病理?yè)p傷，促使精原細(xì)胞增殖與分化，生精小管壁變厚，促進(jìn)精子的形成[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者將淫羊藿苷加入含肝素的mTBM液中，進(jìn)行金霉素?zé)晒馊旧ńY(jié)合體外受精實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷明顯促進(jìn)新鮮豬精子的體外獲能效果[4]。腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力是腫瘤浸潤(rùn)與發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。張京偉等[5]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的黏附、遷移和侵襲能力具有抑制作用。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

前列腺癌細(xì)胞株Du145與PC3購(gòu)自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；淫羊藿苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，用二甲基亞砜(終濃度<0.01%)溶解成相應(yīng)濃度；MTT試劑購(gòu)自Sigma；Transwell小室購(gòu)自Corning；抗Notch-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、Hes-1和GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將前列腺癌細(xì)胞株Du145與PC3加入含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化3 min，進(jìn)行傳代。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 待Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞的密度達(dá)到約80%～90%左右時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107/L，每孔100 μL接種于96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，加入淫羊藿苷使最終濃度為0、5、10、20、40與80 μmol/L，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h，每孔加入MTT試劑20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，搖床上低速振蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為3組，空白對(duì)照(control)組,不加任何處理；溶劑對(duì)照組(vehicle組),加入相應(yīng)體積溶劑；ICA組，給予40 μmol/L淫羊藿苷處理48 h。

2.4 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，離心后棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，往上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出上室，用棉簽擦去上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室面的細(xì)胞15 min；PBS洗滌3次，0.1%結(jié)晶紫染色3 min，蒸餾水漂洗，吹干，置于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。

2.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干，后述步驟與2.4一樣。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后用10%聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入 I 抗(Notch-1、MMP-2與MMP-9： 1∶1 000； Hes-1和GAPDH： 1∶500)室溫孵育1 h，洗膜，加入相應(yīng) II 抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶的積分光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 15.0進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度淫羊藿苷對(duì)Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞活力的影響

與0 μmol/L組相比，其它各組的Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞的活力受到抑制，隨著淫羊藿苷濃度的升高，Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞的活力受到抑制的程度越來(lái)越顯著，呈劑量依賴性，如圖1所示，當(dāng)淫羊藿苷濃度為40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞活力與80 μmol/L組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用40 μmol/L培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

2 淫羊藿苷對(duì)Du145與PC3細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予40 μmol/L淫羊藿苷處理48 h后，Du145與PC3細(xì)胞遷移數(shù)明顯小于空白對(duì)照組；空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

3 淫羊藿苷對(duì)Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予40 μmol/L淫羊藿苷處理48 h后，Du145與PC3細(xì)胞侵襲數(shù)明顯小于空白對(duì)照組；空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 1.The effects of icariin (ICA) on the viability of the prostate cancer lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.

圖1 淫羊藿苷對(duì)Du145細(xì)胞和PC3細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

4 Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)水平變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予40 μmol/L淫羊藿苷處理48 h后，Du145細(xì)胞與PC3細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4。

討 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷呈濃度依賴性抑制前列腺癌Du145細(xì)胞的活力，當(dāng)淫羊藿苷濃度為40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率僅為(39.54±3.29)%，提示淫羊藿苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

Notch受體是一組高度保守的跨膜蛋白，與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡具有密切關(guān)系。研究表明MMPs與Notch-1通路的信號(hào)有關(guān)，MMPs是一類(lèi)鋅依賴性的蛋白水解酶，與腫瘤遷移轉(zhuǎn)移及血管重塑密切相關(guān)[6]，MMP-2與MMP-9是MMPs家族中的一員[7-8]。

Figure 2.The effects of icariin (ICA) on the migration ability of the prostate cancer cell lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

圖2 淫羊藿苷對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 3.The effects of icariin (ICA) on the invasion ability of the prostate cancer cell lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

圖3 淫羊藿苷對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 4.The protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in the Du145 cells and PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

圖4 Du145細(xì)胞和PC3細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表達(dá)水平的變化

MMP-2通過(guò)水解細(xì)胞外基質(zhì)成分促使腫瘤細(xì)胞突破限制，向周?chē)M織侵襲[9]。研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、腎細(xì)胞癌和食管鱗癌等腫瘤中MMP-9的表達(dá)升高，其通過(guò)降解細(xì)胞外機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[10]。另有研究表明，淫羊藿苷可以通過(guò)選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖具有抑制作用[11]。腫瘤的局部轉(zhuǎn)移是癌癥致死率高的重要原因之一，基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)的完整性喪失與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Hes-1作為Notch-1通路下游的靶基因，在Notch-1通路中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)給予淫羊藿苷干預(yù)后，前列腺癌細(xì)胞Du145的遷移與侵襲能力下降，可能與Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)，推測(cè)淫羊藿苷可能通過(guò)抑制Notch-1通路，從而對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移與侵襲中發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，淫羊藿苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞的活力、遷移與侵襲具有明顯的抑制作用，臨床上可用于前列腺癌患者的輔助治療。本研究為淫羊藿苷在臨床上的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of icariin on viability, migration and invasion of prostate cancer cells

ZHANG Wen-hua1, ZHANG Wen-chao2, YU Yuan-dong3

(1DepartmentsofUrology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China;2DepartmentsofUrology,DezhouPeople’sHospital,Dezhou253014,China;3DepartmentsofUrology,theThirdPeople’sHospitalofHenanProvince,Zhengzhou450006,China.E-mail:yuyinhua81@126.com)

AIM: To investigate the effects of icariin on the viability, migration and invasion of the prostate cancer lines Du145 and PC3. METHODS: Du145 cells and PC3 cells were treated with icariin at different concentrations (0, 5, 10, 20, 40 or 80 μmol/L), and the cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell migration and invasion abilities were detected by Transwell assay. The protein expression of Notch-1, matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 and hairy/enhancer of split-1 (Hes-1) was determined by Western blot. RESULTS: The results of MTT assay revealed that icariin inhibited the viabilitiy of Du145 cells and PC3 cells in a dose-dependent manner. The maximal effect was at dose of 40 μmol/L. Icariin treatment significantly decreased the abilities of migration and invasion of Du145 cells and PC-3 cells. Moreover, the protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 was dramatically reduced after icariin treatment. CONCLUSION: Icariin inhibits prostate cancer cell viability, migration and invasion by decreasing the protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1.

Icariin; Prostate cancer cell; Cell viability; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)06- 1017- 04

2016- 10- 18

2017- 02- 28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81172435)

R737.15; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.010

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△通訊作者 Tel: 0371-65228506； E-mail: yuyinhua81@126.com

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