王 茜， 周 兆， 張 雷， 呂林林， 段鋒祺， 劉革修△

(1 廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院藥劑科， 廣東 廣州 511400； 暨南大學(xué) 2血液研究所, 3再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 4生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系， 廣東 廣州 510632； 5廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510010； 6南方醫(yī)科大學(xué)， 廣東 廣州 510515)

達(dá)沙替尼對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響*

王 茜1， 周 兆2, 3， 張 雷2, 4， 呂林林2， 段鋒祺5, 6， 劉革修2, 3△

(1廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院藥劑科， 廣東 廣州 511400； 暨南大學(xué)2血液研究所,3再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系， 廣東 廣州 510632；5廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510010；6南方醫(yī)科大學(xué)， 廣東 廣州 510515)

目的： 在體外探索達(dá)沙替尼對(duì)人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的活力、遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響以及潛在的信號(hào)通路，以評(píng)估達(dá)沙替尼在臨床應(yīng)用中對(duì)骨髓造血微環(huán)境的影響。方法: CCK-8法檢測細(xì)胞活力；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡；同時(shí)采用吖啶橙/溴化乙啶法檢測細(xì)胞凋亡；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌情況；Western blot檢測蛋白激酶B(Akt)蛋白的表達(dá)和磷酸化以及cleaved caspase-3的蛋白水平。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，達(dá)沙替尼(1～10 nmol/L)抑制hBMSCs的活力和遷移；在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用的濃度為7 nmol/L。達(dá)沙替尼促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使更多細(xì)胞的周期阻滯在G1期。此外，hBMSCs TGF-β1和TNF-α的分泌量顯著增加。7 nmol/L達(dá)沙替尼組cleaved caspase-3的蛋白水平增加，胞內(nèi)Akt的蛋白量下調(diào)且其磷酸化受到抑制。結(jié)論: 達(dá)沙替尼以濃度依賴性的方式抑制hBMSCs的活力和遷移，并促進(jìn)TGF-β1和TNF-α的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯和凋亡；達(dá)沙替尼可能通過影響胞內(nèi)Akt蛋白的表達(dá)和磷酸化調(diào)控上述細(xì)胞學(xué)行為。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 達(dá)沙替尼； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞周期； 蛋白激酶B

人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)是骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境的主要成員之一，對(duì)保持造血干細(xì)胞正常的增殖、分化、代謝和功能活動(dòng)有重要作用[1]。但是目前還沒有充分的研究來評(píng)價(jià)達(dá)沙替尼對(duì)正常hBMSCs的影響。因此，本文將從細(xì)胞與分子生物學(xué)水平，研究達(dá)沙替尼對(duì)正常hBMSCs的活力、遷移、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌、細(xì)胞周期及凋亡的影響，并探索參與這些作用的潛在信號(hào)通路，以評(píng)估達(dá)沙替尼在臨床應(yīng)用時(shí)對(duì)造血微環(huán)境中hBMSCs的影響。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

達(dá)沙替尼(ApexBio)溶于DMSO，儲(chǔ)存濃度為20 μmol/L；hBMSCs由廣州軍區(qū)陸軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中心友情提供；吖啶橙(acridine orange，AO)和溴化乙啶(ethidium bromide，EB)購自MYM Biological Technology Limited；DMEM/F12完全培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；CCK-8(Dojindo)；凋亡試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒(南京凱基公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo)；TGF-β1 ELISA試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒(武漢華美)；鼠抗人β-actin單抗(Proteintech)；兔抗人Akt抗體、鼠抗人p-Akt抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG (CST)。

2 主要方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將第4～8代的hBMSCs接種于96孔板中(每孔1 500個(gè))，在含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中過夜后加入達(dá)沙替尼(最終濃度為0 nmol/L、1 nmol/L、4 nmol/L、7 nmol/L和10 nmol/L)，在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄舊的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL CCK-8，在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，然后在酶標(biāo)儀上于452 nm波長處進(jìn)行檢測。

2.2 劃痕法檢測細(xì)胞遷移 將第4～8代的hBMSCs接種于6孔板中(每孔50 000個(gè))，待細(xì)胞在血清含量為15%的DMEM/F12培養(yǎng)基中貼壁并長至融合時(shí)，使用無菌的200 μL槍頭在6孔板中均勻地劃4條相互垂直的直線并用PBS洗去脫落的細(xì)胞，然后加入達(dá)沙替尼使其最終濃度為0 nmol/L、1 nmol/L和7 nmol/L，分別在加藥后0 h、4 h、8 h和12 h時(shí)在帶有拍照系統(tǒng)的倒置顯微鏡(Leica)下觀察拍照，然后使用ImageJ軟件分析圖片，遷移細(xì)胞的多少由遷移至劃痕中細(xì)胞的面積來表示。

總之，針對(duì)性護(hù)理具有科學(xué)、合理、全面性，用于CRRT患者中，能夠增加滿意度，降低堵管、感染、非計(jì)劃性下機(jī)發(fā)生率。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡 將第4～8代的hBMSCs接種于25T培養(yǎng)瓶中，在含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)加入達(dá)沙替尼，終濃度為7 nmol/L，并設(shè)置溶劑對(duì)照組(0 nmol/L)；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于帶有拍照系統(tǒng)的倒置顯微鏡(Leica)下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)；然后收集所有的細(xì)胞(包括細(xì)胞培養(yǎng)液中的)，參考試劑盒上提供的方法分別對(duì)其進(jìn)行周期染色和凋亡染色(PI單染和Annexin V-FITC/PI雙染)，接著于流式細(xì)胞儀(ACEA)上檢測分析。

2.4 AO/EB染色檢測細(xì)胞凋亡 將第4～8代的hBMSCs接種于25T培養(yǎng)瓶中，在含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)分別加入達(dá)沙替尼，終濃度分別為4 nmol/L和7 nmol/L,并設(shè)置溶劑對(duì)照組(0 nmol/L)；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集所有細(xì)胞(包括細(xì)胞培養(yǎng)液中的)進(jìn)行AO/EB染色，該法由Ribble 等[2]的方法改進(jìn)而來。簡而言之，將收集的細(xì)胞用適量的PBS重懸混勻，并吸取50～100 μL的細(xì)胞混懸液于載玻片上進(jìn)行涂片，接著滴加50 μL的AO/EB混合液(濃度均為10 mg/L)并蓋上蓋玻片，然后立即在正立熒光顯微鏡(Leica)下拍照觀察。AO能透過所有的細(xì)胞膜，并將細(xì)胞核染成綠色，EB只能被細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞吸收，將核染成紅色。因此，活細(xì)胞擁有正常的綠色核；早凋的細(xì)胞核內(nèi)有聚縮的染色體片段，擁有更亮的綠色的核；晚凋的細(xì)胞展現(xiàn)出聚縮的片段化的橙色的染色體；壞死的細(xì)胞則顯示出正常的橙色的核。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 將第4～8代的hBMSCs接種到25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)加入達(dá)沙替尼使其最終濃度為7 nmol/L，并設(shè)置溶劑對(duì)照組(0 nmol/L)；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心10 min收集上清，然后根據(jù)試劑盒提供的方法檢測上清內(nèi)TGF-β1和TNF-α的量。

2.6 Western blot檢測Akt、p-Akt和cleaved caspase-3的蛋白水平 將第4～8代的hBMSCs接種到25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在含15%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)加入達(dá)沙替尼，終濃度為7 nmol/L，并設(shè)置溶劑對(duì)照組(0 nmol/L)；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后收集所有的細(xì)胞(包括細(xì)胞培養(yǎng)液中的)，RIPA裂解法提取細(xì)胞總蛋白，并使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、孵 I 抗、洗膜、孵 II 抗和ECL發(fā)光，最后在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光和熒光凝膠成像系統(tǒng)(Uvitec)中顯影拍照觀察，并用Gel-Pro Analyzer 6.0 軟件對(duì)照片進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。此外，本研究應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用GraphPad Prism 7.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖；兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的多重比較采用Bonferroni法；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 達(dá)沙替尼抑制hBMSCs的細(xì)胞活力

從圖1可知不同濃度的達(dá)沙替尼處理24 h對(duì)細(xì)胞活力的抑制程度不同。當(dāng)達(dá)沙替尼的濃度為1 nmol/L時(shí)，其對(duì)hBMSCs已有明顯的抑制作用(P<0.01)，說明hBMSCs對(duì)達(dá)沙替尼很敏感；隨著藥物濃度的增大，hBMSCs的細(xì)胞活性逐漸降低；當(dāng)藥物濃度達(dá)7 nmol/L時(shí)，達(dá)沙替尼產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用，但是此時(shí)hBMSCs的細(xì)胞活性與藥物濃度為10 nmol/L時(shí)的細(xì)胞活性沒有明顯的差別。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，采用的藥物濃度為7 nmol/L。

Figure 1.Dasatinib inhibited the viability of hBMSCs in a dose-dependent manner. Mean±SD.n=4.**P<0.01vs0 nmol/L；#P<0.05vs4 nmol/L.

圖1 達(dá)沙替尼以濃度依賴性的方式抑制hBMSCs的活性

2 達(dá)沙替尼抑制hBMSCs遷移

hBMSCs長至融合后，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)以檢測達(dá)沙替尼對(duì)hBMSCs遷移能力的影響。從圖2可以看出達(dá)沙替尼對(duì)hBMSCs的遷移有明顯的抑制作用，尤其是在7 nmol/L濃度時(shí)，hBMSCs的遷移幾乎被完全抑制。在觀察的12 h內(nèi)，溶劑對(duì)照組的hBMSCs逐漸遷移至劃痕中；但是可清楚地看到，在第8～12 h時(shí)，遷移細(xì)胞的數(shù)量陡增；而1 nmol/L組的細(xì)胞在觀察的時(shí)間內(nèi)遷移的數(shù)量有限。在第12 h時(shí)，溶劑對(duì)照組的劃痕已經(jīng)愈合，但是1 nmol/L組的劃痕內(nèi)還有很大的空間；而7 nmol/L組各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞劃痕面積基本沒有變化。

3 達(dá)沙替尼阻滯hBMSCs的細(xì)胞周期

達(dá)沙替尼處理24 h后，與溶劑對(duì)照相比，7 nmol/L組有更多的細(xì)胞處于G1期，并且兩者有顯著的差異(P<0.01)，見圖3。

4 達(dá)沙替尼促進(jìn)hBMSCs凋亡

達(dá)沙替尼處理24 h后，進(jìn)行AO/EB染色，從圖4A可以看出溶劑對(duì)照組的細(xì)胞擁有正常的圓形且綠色的細(xì)胞核，1 nmol/L組的細(xì)胞顯示出許多橙色，而7 nmol/L組的細(xì)胞則展現(xiàn)出更多的橙色，且核內(nèi)染色體發(fā)生了聚縮(在圖中表現(xiàn)為局部的亮橙色)。進(jìn)一步地，我們通過流式細(xì)胞術(shù)的精確檢測發(fā)現(xiàn)，達(dá)沙替尼處理24 h后，hBMSCs的凋亡率明顯上升(P<0.01)，見圖4B。此外，達(dá)沙替尼還明顯地改變了hBMSCs的細(xì)胞形態(tài)：hBMSCs不再呈現(xiàn)出典型的長梭形，細(xì)胞回縮，細(xì)胞與細(xì)胞之間更加孤立，見圖5。

Figure 2.Dasatinib inhibited the migration ability of hBMSCs (×100). The areas of migratory cells were normalized to the value of D0 group at 12 h. D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D1: concentration of dasatinib was 1 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L. Mean±SD.n=4.##P<0.01vsD0；△△P<0.01vsD1.

圖2 達(dá)沙替尼抑制hBMSCs的遷移

Figure 3.Dasatinib induced cell cycle arrest of the hBMSCs. D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsD0.

圖3 達(dá)沙替尼阻滯hBMSCs的細(xì)胞周期

5 達(dá)沙替尼促進(jìn)hBMSCs炎癥因子的分泌

達(dá)沙替尼處理12 h后，與溶劑對(duì)照組相比，7 nmol/L組上清液中的TGF-β1和TNF-α的量顯著增加(P<0.01)，見圖6。

6 達(dá)沙替尼對(duì)hBMSCs內(nèi)Akt總蛋白和磷酸化水平以及凋亡相關(guān)蛋白的影響

達(dá)沙替尼處理12 h后，7 nmol/L組Akt的蛋白量相對(duì)于溶劑對(duì)照組顯著下降(P<0.01),同時(shí)p-Akt的蛋白量也顯著下降(P<0.01)；但是，cleaved caspase-3的蛋白量明顯上升(P<0.01)，見圖7。

討 論

在Src家族激酶中有9個(gè)成員：c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Yrk、Lyn、Blk、Hck和Lck[3]；其中Src、Fyn 和Yes廣泛地表達(dá)于各種細(xì)胞中，而其它成員通常表達(dá)于造血細(xì)胞中；而且Src蛋白在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著重要的作用[4]。達(dá)沙替尼為Src家族酪氨酸激酶抑制劑，因此其在臨床應(yīng)用的過程中可能會(huì)對(duì)正常的組織細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響。所以，本文探索了達(dá)沙替尼對(duì)hBMSCs活力、凋亡和遷移等生物學(xué)特性及對(duì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路——PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果證明達(dá)沙替尼可能通過抑制Akt通路抑制hBMSCs的細(xì)胞活力和遷移，阻滯hBMSCs的細(xì)胞周期，促進(jìn)其凋亡。hBMSCs是骨髓造血細(xì)胞微環(huán)境的重要成員，對(duì)機(jī)體的造血有重要的支持作用。因此達(dá)沙替尼的骨髓抑制作用也得到一定的解釋。

有很多研究表明達(dá)沙替尼抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖，并且促進(jìn)其凋亡[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼的濃度為1 nmol/L時(shí)，其對(duì)hBMSCs已有明顯的抑制作用，而臨床上達(dá)沙替尼的使用濃度可高達(dá)300 nmol/L[8]，說明hBMSCs對(duì)達(dá)沙替尼很敏感。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞固縮，細(xì)胞核內(nèi)染色體聚縮，細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞周期阻滯。這些結(jié)果證明達(dá)沙替尼在劑量比較低時(shí)以濃度依賴性的方式抑制hBMSCs的生長，破壞細(xì)胞之間的聯(lián)系，使hBMSCs的細(xì)胞周期阻滯在G1期，并誘導(dǎo)其凋亡。

Figure 4.Dasatinib promoted the apoptosis of hBMSCs. A: AO/EB staining was used to detected apoptosis； B: the apoptosis of hBMSCs was detected by flow cytometry. D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D1: concentration of dasatinib was 1 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsD0.

圖4 達(dá)沙替尼促進(jìn)hBMSCs的凋亡

Figure 5.The effect of dasatinib on the morphological changes of hBMSCs (×100). D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L.

圖5 達(dá)沙替尼對(duì)hBMSCs形態(tài)的影響

在癌細(xì)胞中，Src激酶的功能異常會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤和擴(kuò)散[9]。而達(dá)沙替尼抗癌的作用機(jī)制就包括抑制Src家族激酶以抑制癌細(xì)胞的遷移擴(kuò)散。且有研究表明抑制Src可抑制正常小鼠胚胎纖維原細(xì)胞的遷移[10]。因此，達(dá)沙替尼可能會(huì)影響hBMSCs的遷移。本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼濃度為1 nmol/L時(shí)，其對(duì)hBMSCs遷移能力的抑制很強(qiáng)烈；在觀察的第12 h，D0組的劃痕已經(jīng)愈合，而1 nmol/L組的細(xì)胞只有很少的一部分發(fā)生了遷移。而7 nmol/L組，hBMSCs的遷移基本上完全被抑制。所以本研究結(jié)果表明達(dá)沙替尼在劑量比較低時(shí)可強(qiáng)烈地抑制hBMSCs的遷移。

Figure 6.Dasatinib promoted the secretion of TGF- β1 and TNF-α. D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsD0.

圖6 達(dá)沙替尼促進(jìn)hBMSCs分泌更多的炎癥因子TGF- β1和TNF-α

Figure 7.The effect of dasatinib on the protein levels of Akt, p-Akt and cleaved caspase-3 in the hBMSCs. D0: concentration of dasatinib was 0 nmol/L; D7: concentration of dasatinib was 7 nmol/L. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsD0.

圖7 達(dá)沙替尼對(duì)Akt、p-Akt蛋及cleaved caspase-3蛋白水平的影響

TGF-β屬于一系列具有多種功能的轉(zhuǎn)化生長因子超家族，在多種細(xì)胞中參與細(xì)胞的增殖、分化以及其它細(xì)胞功能的調(diào)控。同時(shí)它也是一種具有消極作用的自分泌生長因子，其異常的活化可引起細(xì)胞的凋亡，Kulkarni 等[11]的研究證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，還有研究證明TGF-β在細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要的作用，它阻止細(xì)胞通過G1期[12]。本研究的結(jié)果顯示：與1 nmol/L組相比，7 nmol/L組的細(xì)胞分泌更多的TGF-β1。這與達(dá)沙替尼處理后細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凋亡和細(xì)胞周期的G1期阻滯是一致的。所以，達(dá)沙替尼促進(jìn)hBMSCs分泌更多的TGF-β1，而自分泌的TGF-β1又促進(jìn)了hBMSCs的凋亡和細(xì)胞周期的阻滯。

腫瘤壞死因子是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要由激活的單核-巨噬細(xì)胞分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘發(fā)炎癥反應(yīng)是其主要的生理效應(yīng)。其屬于死亡配體，通過外源性信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，即通過caspase-8/caspase-3通路誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。達(dá)沙替尼處理后的hBMSCs上清液中TNF-α的量劇增；這與達(dá)沙替尼處理后細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凋亡和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)量增加是一致的。這些結(jié)果表明達(dá)沙替尼促使hBMSCs分泌更多的TNF-α，而TNF-α又促進(jìn)了hBMSCs的凋亡。

雖然達(dá)沙替尼的抗癌作用主要體現(xiàn)為對(duì)Bcr-Abl酪氨酸激酶和Src家族酪氨酸激酶的抑制，但胞內(nèi)的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜、相互影響。已有研究表明在多種腫瘤細(xì)胞中，Akt信號(hào)通路也參與了達(dá)沙替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[13-14]。Akt蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控細(xì)胞的許多生命活動(dòng)，如細(xì)胞存活、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的代謝等。我們的結(jié)果顯示達(dá)沙替尼處理后Akt蛋白的蛋白量降低，并且其磷酸化受到抑制。與此同時(shí)，細(xì)胞又表現(xiàn)出凋亡增加，周期阻滯，遷移受阻，增殖抑制，促凋亡細(xì)胞因子分泌量增加的現(xiàn)象，結(jié)合Akt蛋白在細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要作用和多重功能，我們可以得出推論：達(dá)沙替尼可能通過下調(diào)胞內(nèi)Akt蛋白的表達(dá)，抑制Akt蛋白的磷酸化，激活或者抑制了胞內(nèi)的一些信號(hào)通路，從而對(duì)hBMSCs的生命活動(dòng)產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究證明達(dá)沙替尼在劑量比較低時(shí)促進(jìn)細(xì)胞因子TGF-β1和TNF-α的分泌，阻滯hBMSCs的細(xì)胞周期，抑制其生長和遷移，并且促進(jìn)其凋亡，而Akt信號(hào)通路的抑制參與了這些過程的發(fā)生。達(dá)沙替尼是治療白血病的良藥，但是其治療過程中的副作用也不能忽視。因?yàn)閔BMSCs對(duì)骨髓內(nèi)的造血細(xì)胞有重要的支持作用，而達(dá)沙替尼在臨床應(yīng)用中伴隨著一定程度的骨髓抑制。結(jié)合本文的研究結(jié)果，我們可以大膽地推測，達(dá)沙替尼的骨髓抑制作用可能跟其對(duì)hBMSCs的抑制有關(guān)。所以，本研究的結(jié)果可對(duì)達(dá)沙替尼的臨床應(yīng)用提供支持，以采取必要的方法消除或減輕其對(duì)hBMSCs的抑制作用，從而減輕其副作用。由于本研究主要涉及的是體外實(shí)驗(yàn)，至于其在體內(nèi)時(shí)對(duì)hBMSCs的影響還需要進(jìn)一步的研究探索。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of dasatinib on biological properties of human bone marrow mesenchymal stem cells

WANG Qian1, ZHOU Zhao2, 3, ZHANG Lei2, 4, Lü Lin-lin2, DUAN Feng-qi5, 6, LIU Ge-xiu2, 3

(1DepartmentofPharmacy,PanyuHexianMemorialHospitalofGuangzhou,Guangzhou511400,China;2InstituteofHematology，3KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation，4DepartmentofBioengineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;5DepartmentofHematology,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China;6SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To explore the effect of dasatinib on the viability, migration, cell cycle and apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs), as well as the underlying signal pathway to evaluate the influence of dasatinib on hematopoietic microenvironment clinically. METHODS: The cell viability was measured by CCK-8 assay. The migration ability was detected by wound healing assay. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. Acridine orange/ethidium bromide staining was also used to detected apoptosis. The secretion of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA. The protein levels of cleaved caspase-3, protein kinase B (Akt) and phosphorylated Akt were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, dasatinib at 1～10 nmol/L suppressed the viability and migration ability of hBMSCs, and dasatinib at concentration of 7 nmol/L was adopted in the following assays. Dasatinib promoted apoptosis, and blocked the cell cycle in G1phase. In addition, the secretion of TGF-β1 and TNF-α was increased markedly. The protein levels of cleaved caspase-3 was increased, but the protein levels of Akt and phosphorylated Akt were decreased. CONCLUSION: Dasatinib inhibits the viability and migration ability of hBMSCs in a dose-dependent manner, promotes the secretion TGF-β1 and TNF-α, and induces cell cycle arrest and apoptosis. Dasatinib might regulate the biological behaviors of hBMSCs observed above by modulating the expression and phosphorylation of Akt.

Human bone marrow mesenchymal stem cells; Dasatinib; Cell proliferation; Cell migration; Apoptosis; Cell cycle; Protein kinase B

1000- 4718(2017)06- 0993- 07

2017- 04- 11

2017- 05- 03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270568)

R363.2； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.006

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