許 濤 陳海燕 張初苗 黃琴花

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院燒傷整形科，上海 201508)

老年燒傷患者體內(nèi)病理反應(yīng)的變化

許 濤 陳海燕1張初苗1黃琴花1

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院燒傷整形科，上海 201508)

目的 探究老年燒傷患者體內(nèi)的病理反應(yīng)變化。方法 選取老年燒傷患者(實驗組)、健康老人(對照組)為研究對象。分別于患者燒傷后0～3 d、7～10 d和14～17 d取血漿及皮膚組織。檢查血清及皮膚組織中炎癥和氧化應(yīng)激水平及皮膚組織中愈合相關(guān)蛋白β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、激活蛋白(AP)-1表達(dá)情況、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞素-2P45(NF-E2)相關(guān)因子(Nrf)2、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB核積累量及IκB磷酸化水平。結(jié)果 與對照組相比，燒傷后0～3 d和7～10 d患者血清和皮膚組織中炎癥及氧化應(yīng)激水平、皮膚組織中NF-κB核積累量及IκB磷酸化水平顯著升高，皮膚組織中β-catenin、TGF-β、AP-1表達(dá)及Nrf2核積累量顯著下降(均P<0.05)，且這兩個時間段間各病理水平無顯著差異(P>0.05)；燒傷后14～17 d，患者血清和皮膚組織中炎癥和氧化應(yīng)激水平，皮膚組織中β-catenin、TGF-β、AP-1表達(dá)水平，Nrf2、NF-κB核積累量及IκB磷酸化水平相比于0～3 d和7～10 d患者得到顯著改善(P<0.05)。結(jié)論 老年燒傷患者體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激病理反應(yīng)在燒傷后0～10 d內(nèi)持續(xù)處于較高水平，而在14～17 d出現(xiàn)恢復(fù)。

燒傷；炎癥；氧化應(yīng)激

燒傷不僅僅是簡單的體表皮膚受損，它還會引起機(jī)體一系列的應(yīng)激反應(yīng)和免疫紊亂〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)老年人群尤其容易受到燒傷的傷害〔3〕。老年燒傷多為生活燒傷，燒傷后死亡率高，愈合慢，易引發(fā)并發(fā)癥，病情易被掩蓋〔4，5〕。老年燒傷患者的治療預(yù)后受到許多因素的影響。在治療過程中感染是威脅老年燒傷患者的關(guān)鍵性因素〔6〕，其來源于皮膚黏膜損傷破壞使細(xì)菌在燒傷部位定植和燒傷導(dǎo)致的機(jī)體免疫失調(diào)而引起的機(jī)體內(nèi)菌群失調(diào)〔7，8〕；此外，老年燒傷病情掩蓋是影響老年燒傷患者治療的另一個重要因素〔9〕。本研究旨在明確老年燒傷患者燒傷后體內(nèi)病理反應(yīng)的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2014年10月至2015年10月老年燒傷住院患者80例，男59例，女21例，年齡66～75歲，平均(69.8±3.5)歲，患者為中重度燒傷。健康老人30例為對照組，男16例，女14例，年齡65～73歲，平均年齡(68.6±3.1)歲；兩組性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組均無神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腦血管病及癡呆病史、凝血功能障礙、惡性腫瘤，且近6個月無服用免疫抑制劑藥物史。

1.2 血漿和皮膚組織獲取 于早晨8點左右分別抽取燒傷后0～3 d內(nèi)、10～13 d內(nèi)、17～20 d內(nèi)的患者和健康受試者的血漿，1 700 r/min離心10 min，取血清，將血清凍于-20℃冰箱中備用；取患者燒傷后0～3 d內(nèi)、7～10 d內(nèi)、14～17 d內(nèi)手術(shù)切除的燒傷皮膚組織以及整形手術(shù)剩余的老人健康的皮膚組織，將皮膚組織置于液氮中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法 采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測兩組血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量；人IL-1β、IL-6、TNF-α和CRP ELISA檢測試劑盒購于R&D公司，實驗操作均按說明書操作。將冷凍皮膚組織研磨，采用Trizol法提取皮膚組織的總RNA，以總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選用在皮膚組織中穩(wěn)定表達(dá)的β-actin 作為內(nèi)參，利用real-time PCR 測定兩組燒傷皮膚組織和健康皮膚組織中β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、激活蛋白(AP)-1 mRNA表達(dá)水平，β-catenin上游引物：5′-GACTGGAAGAGCGGAGAGTACTG-3′，下游引物：5′-CCTTGATGGCGTCCAGGTT-3′；TGF-β上游引物：5′-CCGAGATCTCACCAC-3′，下游引物：5′-TCCAGAGCTACATGACACAG-3′；AP-1上游引物：5′-TAGTCCTTCCTACCCCATTCC-3′，下游引物：5′-TTGGTCCTTAGCCACCCTTC-3′；β-actin上游引物：5′-ACATCTGCTGAAGGTGGAC-3′，下游引物：5′-GGTACCACCATACCAGG-3′。將冷凍皮膚組織研磨，采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取總蛋白和核蛋白，試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司，測定組織中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的酶活，ROS、MDA、SOD、CAT檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；采用Western印跡檢測皮膚組織中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞素-2P45(NF-E2)相關(guān)因子(Nrf)2的核積累量及IκB磷酸化水平。兔抗人β-actin、兔抗人IκB和p-IκB抗體購于Cell Signaling Technology公司；兔抗人NF-κB抗體、兔抗人Lamin B抗體購于Affinity公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差。

2 結(jié) 果

2.1 老年燒傷患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平比較 與對照組相比，燒傷患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平顯著升高(P<0.05)；燒傷后0～3 d內(nèi)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平與燒傷后7～10 d內(nèi)無顯著差異(P>0.05)；而燒傷后14～17 d內(nèi)相比于燒傷后0～3 d及燒傷后7～10 d內(nèi)均顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2 老年燒傷患者皮膚組織中ROS、MDA含量和SOD、CAT活性的變化 與對照組相比，患者燒傷皮膚組織中ROS、MDA含量顯著升高，SOD、CAT活性顯著降低(均P<0.05)；燒傷后0～3 d內(nèi)燒傷組織中ROS、MDA含量及SOD、CAT活性與燒傷后7～10 d內(nèi)比較無顯著差異(P>0.05)；而燒傷后14～17 d內(nèi)相比于燒傷后0～3 d及燒傷后7～10 d內(nèi)燒傷組織得到顯著改善(P<0.05)，見表1。

2.3 老年燒傷患者皮膚組織中β-catenin、TGF-β mRNA表達(dá)水平的變化 與正常皮膚組織相比，患者燒傷皮膚組織中β-catenin、TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；燒傷后0～3 d內(nèi)燒傷組織中β-catenin、TGF-β mRNA表達(dá)水平與燒傷后7～10 d內(nèi)比較無顯著差異(P>0.05)；而燒傷后14～17 d內(nèi)相比于燒傷后0～3 d及燒傷后7～10 d內(nèi)的燒傷組織得到顯著改善(P<0.05)。

2.4 老年燒傷患者皮膚組織中IκB磷酸化水平及NF-κB和Nrf2的核積累量的變化 與正常皮膚組織相比，患者燒傷皮膚組織中IκB磷酸化水平及NF-κB核積累量顯著升高(P<0.05)，Nrf2的核積累量顯著降低(P<0.05)；燒傷后0～3 d內(nèi)燒傷組織中IκB磷酸化水平及NF-κB、Nrf2核積累量與燒傷后7～10 d內(nèi)比較無顯著差異(P>0.05)；而燒傷后14～17 d內(nèi)相比于燒傷后0～3 d及燒傷后7～10 d內(nèi)燒傷組織得到顯著改善(P<0.05)，見圖1。

表1 不同組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量及皮膚組織ROS、MDA含量、SOD、CAT活性比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與0～3 d組比較：3)P<0.05；與7～10 d組比較：4)P<0.05

圖1 不同組皮膚組織IκB磷酸化水平及NF-κB p65、 Nrf2核積累量

3 討 論

燒傷不僅危害了老年患者的皮膚功能，其病理反應(yīng)還嚴(yán)重影響了機(jī)體的內(nèi)生理功能〔2〕。由于皮膚是非常重要的生理屏障，其破壞會伴隨著多種病理反應(yīng)。當(dāng)皮膚細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞會釋放磷脂酶、炎癥因子、氧自由基等因子，使機(jī)體處于高炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的病理狀態(tài)，這些病理反應(yīng)嚴(yán)重影響老年燒傷患者病情的發(fā)展〔2，10〕。炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的復(fù)雜的防御反應(yīng)，癥狀表現(xiàn)為局部紅腫熱痛，病理檢查可發(fā)現(xiàn)大量炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞的局部浸潤和組織壞死，其中心環(huán)節(jié)是血管反應(yīng)〔2〕。研究表明，燒傷患者體內(nèi)炎癥水平顯著升高〔10〕。其原因是燒傷后大量皮膚細(xì)胞受到損傷，損傷的細(xì)胞釋放大量的炎性因子，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的溶酶體，激活體內(nèi)免疫細(xì)胞、啟動炎癥連鎖級聯(lián)反應(yīng)，最終通過引起廣泛的組織和血管內(nèi)炎癥〔10〕。研究表明機(jī)體內(nèi)一些因子如細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CRP水平能夠反映機(jī)體內(nèi)炎癥水平〔11〕。NF-κB是一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中，與NF-κB的抑制性蛋白IκB結(jié)合而呈非活性狀態(tài)〔12〕。研究顯示，它受多種刺激物，如TNF-κ、IL-1、蛋白激酶C激活劑、有絲分裂原、氧化應(yīng)激、細(xì)菌、病毒、免疫刺激劑等激活〔13〕。激活的NF-κB與IκB解離后入核與靶基因啟動子/增強(qiáng)子上的κB位點結(jié)合，從而調(diào)控許多靶基因的表達(dá)，因此被譽(yù)為控制早期基因表達(dá)的基因開關(guān)，炎癥反應(yīng)包括眾多分子參與，NF-κB在炎癥反應(yīng)中居于中心地位〔14〕。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體ROS的產(chǎn)生過多或(和)機(jī)體抗氧化能力下降，ROS的清除不足，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)增多并引起細(xì)胞氧化損傷的病理過程〔15〕。氧化應(yīng)激的主要特征是組織或細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量顯著升高，而抗氧化酶活性降低〔15〕。當(dāng)機(jī)體處于病理情況下，體內(nèi)的自由基水平會顯著升高，進(jìn)而引起生物膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)、核酸變性，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷，加速病情〔2，16〕。Nrf2是一個富含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是細(xì)胞和機(jī)體對抗氧化應(yīng)激損傷的中樞調(diào)控者，普遍表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時，Nrf2與其抑制蛋白解離，然后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活調(diào)控的抗氧化基因表達(dá)〔17〕。本研究結(jié)果表明，老年燒傷患者燒傷后0～10 d內(nèi)體內(nèi)持續(xù)處于高氧化應(yīng)激病理反應(yīng)狀態(tài)，而在14～17 d內(nèi)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平開始顯著下降。

此外，研究發(fā)現(xiàn)β-catenin、TGF-β能夠促進(jìn)燒傷皮膚的愈合及燒傷皮膚的修復(fù)〔18〕。本研究結(jié)果表明，老年燒傷患者燒傷后0～10 d內(nèi)體內(nèi)促愈合相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平顯著降低，而在14～17 d內(nèi)患者體內(nèi)體內(nèi)促愈合相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平得到顯著改善。

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〔2016-12-15修回〕

(編輯 滕欣航)

陳海燕(1971-)，女，住院醫(yī)師，主要從事燒傷后疤痕整形、乳腺整形美容研究。

許 濤(1970-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事燒傷后疤痕整形、乳腺整形美容研究。

R644

A

1005-9202(2017)11-2771-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.078

1 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院體檢科