穆清爽 張 慧 汪文娟 薄聰聰 黎 靜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830063)

miRNA-126在支氣管哮喘中的表達(dá)及臨床意義

穆清爽 張 慧 汪文娟 薄聰聰 黎 靜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830063)

目的 探討檢測miRNA-126基因在支氣管哮喘患者及健康者外周血中的表達(dá)及在哮喘急性加重期的臨床意義。方法 哮喘急性加重期患者24例為哮喘組，健康志愿者24例為對照組。留取外周血標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miRNA-126基因的表達(dá)，分析其表達(dá)差異情況以及與白細(xì)胞介素(IL)-6細(xì)胞炎癥因子、嗜酸性細(xì)胞、IgE的關(guān)系，受試者工作特征曲線(ROC)特征評價(jià)miRNA-126基因?qū)χ夤芟\斷的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果 兩組miRNA-126相對含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.444，P=0.015)。哮喘組IL-6、嗜酸性細(xì)胞、IgE比率顯著高于對照組(P<0.01)。miR-126在支氣管哮喘患者血漿中ROC曲線下面積(AUC)為0.294，診斷價(jià)值較低。結(jié)論 miRNA-126在哮喘急性加重期患者外周血中表達(dá)，呈下調(diào)狀態(tài)，可能通過輔助T細(xì)胞(Th)2優(yōu)勢應(yīng)答，使炎性細(xì)胞因子升高，有可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn)。

miRNA-126；哮喘

目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在哮喘中具有重要作用，也能用于哮喘基因個(gè)體易患性判斷〔1〕。其中miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能減少輔助T細(xì)胞(Th)2反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性、嗜酸性細(xì)胞聚集，弱化氣道黏液分泌，從而抑制哮喘炎癥產(chǎn)生〔2〕。本研究旨在探討mRNA-126在支氣管哮喘患者急性發(fā)作期血漿中的表達(dá)水平及其意義。

1 資料與方法

1.1 對象 哮喘組為2015年3～9月新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院部就診的哮喘急性加重期患者血標(biāo)本24例，其中男10例，女14例，年齡21～52歲，中位年齡38歲。診斷和病情分級符合2014年中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會哮喘組制定的專家共識診療規(guī)范。對照組為新疆醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生，其中男12例，女12例，年齡21～23歲，對照組無過敏性鼻炎及呼吸道感染史。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 采集研究對象的空腹靜脈血5 ml，30 min內(nèi)3 000 r/min離心5 min分離血清，置于5 ml離心管中，于4℃條件下16 000 r/min離心10 min，吸出上清液置新的離心管中，置-80℃冰箱低溫保存。

1.2.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒(miRNeasy Mini kit，QIAGEN公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (miScript II RT Kit，QIAGEN公司)，RT-PCR試劑盒(miScript SYBR?Green PCR kit，QIAGEN 公司)。主要儀器:美國ABI 7300Real Time PCR System擴(kuò)增儀。

1.2.3 血漿總RNA的提取和RT-PCR (1)提取總RNA：用超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度，RNA濃度和純度在260/280 nm 下檢測，在1.9～2.20 之間。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體系20 μl：HIFlex Buffer 4 μl，Nucleics Mix 2 μl，RT Enzyme Mix 2 μl，Total RNA(濃度約20 ng/μl)+ RNase-Free 水共12 μl。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(RT-PCR)：引入MiR-126特異性引物(貨號：ms00003430)反應(yīng)體系25 μl：Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，miScript Primer Assay 2 μl，miScript Universal Primer 2 μl，RNase-Free 水10 μl，模板cDNA 1 μl。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15 s，55℃ 45 s，70℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，在相同反應(yīng)條件下同時(shí)檢測MiR-126的擴(kuò)增情況，程序運(yùn)行后數(shù)據(jù)分析用Rotor-Gene Q Series Software軟件，最后得出各樣本的熔解曲線、擴(kuò)增曲線及Ct值。(4)結(jié)果檢測與分析：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，miRNA-126的相對含量為2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)、p檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血漿miRNA-126的表達(dá)水平 miRNA-126在哮喘組和對照組的相對含量分別為(351 540.000±464 095.000)和(568 670.000±459 555.400)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.444，P=0.015)。

2.2 兩組外周血炎性因子比較 與對照組比較，哮喘組中IL-6細(xì)胞炎癥因子、嗜酸性細(xì)胞、IgE水平顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 兩組外周血炎性因子比較

2.3 miRNA-126水平在哮喘診斷中的靈敏度、特異度 受試者工作特征(ROC)曲線分析，miR-126在支氣管哮喘患者血漿中ROC曲線下面積(AUC)為0.294 (95%CI0.130～0.459)，診斷價(jià)值較低。見圖1。

圖1 血漿miRNA-126濃度的ROC曲線分析

3 討 論

哮喘是以持續(xù)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的慢性呼吸道疾病，是呼吸科最常見的慢性呼吸道疾病之一。因?yàn)槠浒l(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，所以，目前治療手段尚不能完全阻止氣道重塑和急性發(fā)作。研究認(rèn)為炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，Th1/Th2細(xì)胞因子平衡學(xué)說是最早被提出的與免疫相關(guān)的支氣管哮喘炎癥發(fā)病機(jī)制學(xué)說〔3〕。Th2優(yōu)勢分化免疫應(yīng)答釋放Th2型細(xì)胞因子增多，加重嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥，導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作〔4〕，miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能減少Th2反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性、嗜酸性細(xì)胞聚集和黏液過度分泌，針對哮喘氣道高反應(yīng)的miRNA治療可達(dá)到抗炎癥的目的〔5〕。在慢性遷延性哮喘小鼠模型中，氣道內(nèi)miRNA-126表達(dá)顯著升高，在慢性激發(fā)期下調(diào)miRNA-126，能減輕氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，改善哮喘的癥狀〔6〕。

單個(gè)microRNA能和數(shù)百種靶向基因結(jié)合，通過對靶基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制，參與炎性疾病及免疫異常相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)，是負(fù)反饋調(diào)節(jié)的重要調(diào)控因子。miRNA-126通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)參與哮喘的炎癥反應(yīng)過程。miRNA-126 在氣道管壁細(xì)胞中依賴髓樣分化因子(MyD)88和Toll樣受體(TLR)4 表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，通過 miRNA拮抗劑抑制miRNA-126高表達(dá)后，抑制Th2 細(xì)胞釋放IL-5 和IL-13炎性細(xì)胞因子，氣道黏液分泌量呈減弱趨勢，從而減輕哮喘急性發(fā)作癥狀〔7，8〕。

在哮喘氣道炎癥的產(chǎn)生過程中，IgE是介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的重要物質(zhì)，IgE 通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，當(dāng)抗原在與機(jī)體再次接觸后，激活I(lǐng)gE復(fù)合物受體，借助肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的表面Fc受體〔9〕，并被T細(xì)胞受體識別，從而激活Th亞群，釋放IL-2、IL-4、IL-6、IL-13等炎性因子。本研究推測miRNA-126下調(diào)可能通過調(diào)節(jié)Th平衡，造成Th2優(yōu)勢應(yīng)答，使B淋巴細(xì)胞增殖分泌IgE，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞及炎性介質(zhì)IL-6增高。而盧蘭等〔10〕研究表明miRNA-126在哮喘患者中高表達(dá)，并可能通過調(diào)節(jié)TSLP 調(diào)控Th2 細(xì)胞的優(yōu)勢分化、Th2 型細(xì)胞因子水平參與哮喘的調(diào)控機(jī)制。

本研究采用RT-PCR法檢測，在空間表達(dá)分辨率、準(zhǔn)確性、靈敏度、特異度方面較之基因芯片技術(shù)和Northern 雜交技術(shù)有無法比擬的優(yōu)勢〔11〕，實(shí)驗(yàn)過程順利，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，出現(xiàn)與既往研究結(jié)論不一致可能與樣本量較少有關(guān)，是否在Th細(xì)胞的反應(yīng)中，有其他關(guān)鍵miRNA影響靶mRNA發(fā)揮作用尚不明確。本研究樣本量少，單一基因表達(dá)診斷價(jià)值低，需聯(lián)合其他miRNAs診斷。

1 Baumjohann D，Ansel KM.MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity〔J〕.Nat Rev Immunol，2013；13(9)：666-78.

2 Sullivan CS，Grundhoff AT，Tevethia S，etal.SV40-encoded microRNAs regulate viral gene expression and reduce susceptibility to cytotoxic T cells〔J〕.Nature，2005;435(7042)：682-6.

3 Mattes J，Collison A，Plank M，etal.Antagonism of microRNA-126 suppresses the effector function of Th2 cells and the development of allergic airways disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2009;106(44)：18704-9.

4 Ray A，Cohn L.Altering the Th1/ Th2 balance as a therapeutic strategy in asthmatic diseases 〔J〕.Curr Opin Investig Drugs，2000;1(4)：442-8.

5 Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，etal. An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation 〔J〕.Ann Med，2008;40(5)：322-35.

6 Mattes J，Yang M，Mahalingam S，etal.Intrinsic defect in T cell production of interleukin (IL)-13 in the absence of both IL-5 and eotaxin precludes the development of eosinophilia and airways hyper-reactivity in experimental asthma〔J〕.J Exp Med，2002;195(11)：1433-44.

7 Collison A，Herbert C，Siegle JS，etal.Altered expression of microRNA in the airway wall in chronic asthma：miR-126 as a potential therapeutic target 〔J〕.BMC Pulm Med,2011;11(1)：29.

8 Lu TX，Rothenberg ME.Diagnostic，functional，and therapeutic roles of microRNA in allergic diseases〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2013;132(1)：3-13.

9 史傳見，呂玉敏，文 川，等.哮喘和慢性肺重疊綜合征患者血清總IgE水平改變及其臨床意義研究〔J〕.臨床肺科雜志，2016；21(2)：283-5,286.

10 盧 蘭，唐漢慶，竇錫彬，等.miRNA-126、TSLP在哮喘患者中的表達(dá)及影響〔J〕.醫(yī)學(xué)信息，2014；(5)：67-8.

11 Schmittgen TD，Lee EJ，Jiang J，etal.Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA〔J〕.Methods，2008;44(1)：31-8.

〔2017-01-09修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(No.XYDCX201435)

黎 靜(1963-)，女，副教授，主任醫(yī)師,主要從事呼吸系統(tǒng)各類疾病的診治，特別重視基礎(chǔ)理論研究。

穆清爽(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌的診治研究。

R56

A

1005-9202(2017)11-2730-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.057